Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
出芽酵母における胞子形成が減数分裂1、遺伝子組換え2のメカニズム、3シグナル伝達細胞による開発のコントロール、開発4の栄養制御、転写時の染色体分離の制御を含む生物学の多くの側面、洞察を提供することが検討されています開発5の規制、および胞子形成6の検討。胞子形成は、保護胞子壁6の堆積に続いて母細胞内の新しい膜区画の形成を含む新規な細胞分裂事象を含みます。胞子形成細胞を調べるこれらの研究は、多くの場合、比較的効率的なやり方7,8で約24時間で胞子形成のプロセスを経ることができる急速に胞子形成酵母株SK1、を利用します。出芽酵母のための胞子形成条件の最適化は、9月13日 、これらの実験について説明したがSは、固体培地上または胞子形成は、培養チューブもしくはフラスコを用いて行われる大規模な液体培養物中で胞子形成を調べました。
ここでは、96マルチウェルプレートフォーマットで酵母を胞子形成するための方法を説明します。我々は、この方法のために、通気が同期および効率的な胞子形成のために重要であることを見つけると、小容量マルチウェルフォーマット十分な胞子形成を確保するための手法を考案しました。細胞は、高スループット技術とタイルライブラリ14-16を使用して高コピー抑制のためのマルチウェルプレートフォーマット、このようなスクリーニングのために最適化された試薬を用いてスクリーニングされる96マルチウェルプレート形式で胞子形成することができます。
ここでは、96マルチウェルフォーマットでSK1酵母を胞子形成するためのプロトコルを提示します。エアレーションは、各ウェル中の攪拌棒やガラスビーズのいずれかの使用を必要とする、効率的な胞子形成するためのキーです。細胞は、ビーズや撹拌棒のいずれかなし振盪インキュベーター中で96マルチウェルプレートに胞子形成されている場合、細胞が効率的に胞子を形成しません。細胞は…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIH(LSH)からマサチューセッツ州ボストン(LSH)およびR15 GM86805の大学のジョセフ・P.ヒーリーの助成金によってサポートされていました。 SMPは、マサチューセッツ州ボストンの大学でサノフィ・ジェンザイムフェローシップによって部分的にサポートされています。
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |