Effektiv Sporulering av<em> Saccharomyces cerevisiae</em> I en 96 Multiwell Format

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

Sporulering i knoppande jäst har studerats för att ge insikter i många aspekter av biologi, inklusive kontroll vid kromosomsegregation under meios ^en mekanismer för genetisk rekombination ^2, kontroll av utvecklingen av cellsignalering ^3, närings kontroll över utveckling ^4, transkriptions reglering av utveckling ^5, och granskningen av sporbildning ^6. Sporbildning innehåller en helt ny celldelnings händelse som innebär bildandet av nya membran fack inom modercellen följt av avsättning av en skyddande spore väggen ^6. Dessa studier som undersöker sporulerande celler drar ofta nytta av den snabbt sporbildande jäststammen SK1, som kan genomgå processen för sporulering i omkring 24 h i ett relativt effektivt sätt ^7,8. Även optimering av sporulering villkoren för spirande jäst har beskrivits ^9-13, dessa experiments undersökte sporulering på fasta medier eller i större skala flytande kulturer där sporulering utförs med hjälp av odlingsrör eller flaskor.

Här beskriver vi en metod för sporbildande jäst i en 96 flerkällsplatta format. Vi finner att för denna metod, är luftning kritisk för synkron och effektiv sporulering, och har tänkt ut tekniker för att säkerställa tillräcklig sporulering en liten volym flerkälls format. Sporbildande i en 96 flerkällsplatta format tillåter celler ses med hög genomströmning tekniker och reagens som är optimerade för en flerkällsplatta format, till exempel screening för höga kopieringsdämpare som använder ett kaklat bibliotek ^14-16.

Protocol

1. Förberedelser för Sporulering Anm. Medierna beskrivs i detta protokoll görs med användning av standardrecept och metoder 13,17 Tabell 1 visar formuleringen för ett L av de olika medier som används i detta protokoll. B…

Representative Results

För att bedöma detta protokoll, var sporulering effektivitetsvinster från sporbildande celler i flerbrunnsplattor (som beskrivits ovan) jämfört med celler sporulerade användning av större volymer i flaskor (tabell 2). Användningen av flerbrunnsplattor inte uppnå hög effektivitet ses när sporbildande i flaskor, där ~ 80% verkningsgrad kan rutinmässigt sett. Sporbildande i flerbrunnsplattor med rätt luftning (som tillhandahålls av glaspärlor eller omr…

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för sporbildande SK1 jäst i en 96 multibrunn format. Luftning är nyckeln till effektiv sporulering, som kräver användning av antingen en omrörare eller en glaspärla i varje brunn. När cellerna sporbildning i en 96 flerkällsplatta i ett skakande inkubator utan antingen en kula eller en omrörare, gör cellerna inte sporer effektivt. Endast en liten ökning av sporbildning effektivitet ses när celler sporulerade utan antingen en kula eller en omrörare i en skakande inkubator, j…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4