Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
Tomurcuklanan maya sporlanma mayoz 1, genetik rekombinasyon 2 mekanizmaları, 3 sinyal hücre tarafından gelişim kontrolü, geliştirme 4 besin kontrolü, transkripsiyonel sırasında kromozom ayrımı kontrolü de dahil olmak üzere biyoloji birçok açıdan, içgörü sağlamak için çalışılmıştır gelişim 5 düzenlenmesi ve spor oluşumu 6 incelenmesi. Spor Oluşumu koruyucu spor duvar 6 birikimi, ardından ana hücreden içinde yeni zar bölümlerine oluşturulmasını içeren yeni bir hücre bölünmesi olayını içerir. Sporlanan hücrelerini inceleyen Bu çalışmalar genellikle nispeten verimli bir şekilde 7,8 yaklaşık 24 saat içinde sporülasyonun sürecinden geçmeleri için hızla sporlanan maya suşu SK1, yararlanmak. Maya tomurcuklanan sporülasyon koşullarının optimizasyonu 9-13, bu deney, tarif edilmiş olmasına rağmens katı ortam üzerinde ya da sporlaşma kültür tüpleri veya şişeleri kullanılarak gerçekleştirilir büyük ölçekli sıvı kültürlerde sporlanmasını incelenmiştir.
Burada, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, maya sporlanan için bir yöntemi tarif eder. Bu yöntem için, havalandırma senkron ve verimli sporülasyonun için kritik olduğunu bulmak ve küçük hacimli multiwell biçimi yeterli sporulasyonunu sağlamak için teknikler geliştirdiler. Hücreler, yüksek verimli teknikleri ve döşemeli kütüphane 14-16 kullanılarak yüksek kopya bastırma için çok oyuklu bir plaka biçiminde, bu tarama için optimize edilmiş reaktifler kullanılarak taranabilir için 96 çukurlu bir levha formatında sporlanan sağlar.
Burada 96 multiwell formatta SK1 maya sporlanan için bir protokol mevcut. Havalandırma Bir karıştırma çubuğu ya da her iyi bir cam boncuk ya kullanımını gerektirir verimli sporlanma için anahtardır. hücreler, bir tane veya bir karıştırma çubuğu ya da olmayan bir çalkalama inkübatöründe 96 çukurlu bir plaka içinde sporule zaman, hücreleri verimli sporlanmalanna yoktur. Hücreler bir boncuk ya da (çalkalama olmaksızın 30 ° C de Tablo 1 olmasına kıyasla bir çalkalama inküba…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH Massachusetts Boston (LSH) ve R15 GM86805 Üniversitesi (LSH) bir Joseph P. Healey hibe ile desteklenmiştir. SMP Massachusetts Boston Üniversitesi'nde Sanofi-Genzyme Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmektedir.
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |