Dygnsrytm klocka reglerar ungefär en tredjedel av Arabidopsis transkriptom, men andelen av gener som beaktas vid tidtagning fortfarande okänd. Här visualisera vi en metod för att snabbt bedöma dygnsrytm fenotyper i någon mutantlinjen av Arabidopsis med hjälp av självlysande avbildning av en dygns reporter transient uttryckt i protoplaster.
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
De flesta levande organismer har en endogen tidtagare för att underlätta en effektiv förhandling av dagliga förändringar i miljön. Detta tidtagare, dygnsrytm klocka reglerar många aspekter av metabolismen och fysiologi hos en organism att förutse förutsägbara förändringar i den yttre miljön. I anläggningar för exempelvis väntan på tidsmässigt förutsägbara patogener eller växtätare attacker minskar kraftigt övergripande känslighet 1-4. Stärkelse metabolism är hårt reglerad av dygnsrytm klocka för att säkerställa att stärkelsereserver sist fram till gryningen om odlas på långa eller korta dagens förhållanden 5. I själva verket, växter med dygns klockor som matchar de 24 hr miljö visar ökad tillväxttakt, kol fixerings priser och överlevnad jämfört med växter som kör en klocka inkompatibla perioden 6. Den omfattande påverkan av dygnsrytmen i alla dessa processer uppstår i stor utsträckning från den rytmiska regleringen av upp till en tredjedelav den totala transkriptom i Arabidopsis 7. Dessa rytmiska genprodukter är involverade i ett brett spektrum av cellulära processer, inklusive metaboliska vägar, hormonsignaleringen och stressreaktioner 7. Ovanpå detta är direkt dygnsrytm reglering av proteiners funktion som fastställts av dygnsrytm reglering av fosforylering 8 och förmodligen andra posttranslationella modifieringar (PTMs).
Vid mitten av dygnsrytm klocka som driver denna dagliga transkriptions omprogrammering ligger ett nätverk av transkriptions / translationella återkopplingar (TTFLs), inklusive morgonen uttryckt gener dygnsrytm klocka SAMBAND en (CCA1) och sen avlånga hypokotyl (LHY) som undertrycka uttrycket av kvällens gener TIMING aV CAB en (TOC1), gigantea (GI) och medlemmarna i kvällskomplexet (EG), LUX ARRHYTHMO (LUX), tidig blomning 3 (ELF3), och ELF4 9-11. tillsammans with pseudo RESPONSE REGULATOR -genes (PRR3, 5, 7, och 9), undertrycker TOC1 CCA1 / LHY expression medan EG verkar som en positiv regulator 12-14. Ytterligare återkopplingsmekanismer, post-transkriptionell och post-translationell reglering av TTFL nätverkskomponenter spelar en viktig roll i tuning dygnsrytm. Hittills är den vanligast förekommande PTM identifieras på dygnsrytm klocka proteiner fosforylering 15. Fosforylering av CCA1 av Kaseinkinas 2 (CK2) påverkar dess bindning till mål initiativtagare 16 och är viktigt för temperaturkompensering av dygnsrytm klockan 17. PRR proteiner fosforyleras differentiellt över dygnscykeln, och fosforylering av TOC1 påverkar interaktion med sin negativ regulator, kvällen faser klocka komponent ZEITLUPE (ZTL) 18. Dessa exempel illustrerar hur PTMs och protein-proteininteraktioner tune den TTFL nätverket i en 24-hrtranskriptionell oscillator. För en mer detaljerad introduktion till transkriptionsklocknätet och dess reglering, utmärkta senaste omdömena finns tillgängliga (t.ex. referens 15).
Men det återstår mindre klart är i vilken utsträckning rytmiskt reglerade processer och andra aspekter av cellulär metabolism mata tillbaka in i tidtagningen själva mekanismen. Omfattande screening av Arabidopsis mutanter för fel klock kan få ytterligare kunskap om vilka mekanismer eller signalvägar kan vara inblandade i genereringen av 24 h rytmer från en TTFL nätverk. För detta ändamål, Kim och Somers tidigare publicerade ett genombrott metod för effektiv och snabb analys av klockfunktionen i någon Arabidopsis linje 19. Baserat på användningen av övergående uttryck i protoplaster, denna metod överträffar behovet av stabila transgena linjerna eller korsar till självlysande klocka markör linjer. Här, vi visualisera en högavkastande protoplast isolation metod 20 i kombination med en optimerad protokoll för att screena dygnsrytm defekter genom självlysande avbildning av transient uttryckta markörerna klock i en 96-brunnsplattläsare.
Vi kommer att jämföra vildtyp Collaboration 0 Arabidopsis mutanter välkaraktäriserade klock att bekräfta den metod som beskrivs här framgångsrikt upptäcker förändrade dygnsrytm. Protoplaster från dessa linjer transfekteras med en reporterkonstruktion som uttrycker eldflugeluciferas från dygns CCA1 promotorn; CCA1pro: LUC 19. Luciferas katalyserar flerstegs reaktion, i vilken luciferin omvandlas till elektroniskt exciterat oxyluciferin som sänder ut ljus 21, som avbildas över tiden för att utvärdera den tid, amplitud och fas av transkriptionella rytmer i dessa protoplaster.
Protokollet består av tre huvuddelar; isolera protoplasts, transfektion protoplasterna med reportern plasmiden, och självlysande imåldrande. Dessa tre delar bör alltid utföras på en enda dag, med användning av nyberedda buffertar och reagens. Växternas tillväxt och rening av tillräckliga mängder av reporterplasmid bör utföras i förväg och är inte visualiseras i detta protokoll.
Här presenterar vi en snabb analys för att screena dygnsrytm period defekter i Arabidopsis linjer, inklusive protoplastisolering, transfektion, och luminecent avbildning. Dygnsrytm period vildtyp Arabidopsis och klockan mutanter cca1 / LHY, ZTL och CCA1 -OX beräknades från mätningar av luminiscens från en CCA1pro: LUC reporter och befunnits vara i överensstämmelse med publicerade data som genereras från hela anläggningar som använder mer tids- konsumerar transgena metoder (tabell 2). Med användning av denna analys för att screena Arabidopsis-mutanter undviker första krav för att generera transgena luminiscenta linjer, vilket är tidsödande och kan endast avslöja att en viss mutant uppvisar vildtyp rytmer. En klar fördel med detta protokoll är att alla Arabidopsis linje kan screenas på kort tid för förändrade dygnstranskriptions rytmer, som kommer att hjälpa att identifiera fler gener som påverkar tidtagning i växter.
<p class= "Jove_content"> Isolering av protoplaster kan vara arbetskrävande, särskilt om den mutanta linjen visar en överskuggas fenotyp. Tidigare rapporterade metoder för att generera protoplaster innebär att skära blad eller plantor i tunna strimlor och vakuum infiltrerar remsorna med enzymlösning för att göra det möjligt för enzymer för att nå cellväggarna 26,27. Den efterföljande digerering kräver minst tre timmars inkubation i mörker för att frigöra protoplasterna i enzymlösningen. När vakuum infiltration inte tillämpas, är inkubationstiden upp till 18 timmar rekommenderas. I protokollet presenteras här, är vakuuminfiltration onödiga eftersom epidermal cellskiktet ogenomträngligt för enzymerna avlägsnas med tejp. När du skapar protoplaster genom att skära växtmaterial är det nödvändigt att separera protoplaster från cellväggen skräp efter matsmältningen, Detta görs vanligtvis genom filtrering av lösningen eller rena den på en socker gradient 27,26. Här kommer några osmält vävnad kvar på autoklav bandet efterdigestion, så filtrering och socker gradient rening av protoplasterna kan utelämnas. Det finns en chans att den stress som följer av långvarig protoplasting förfaranden påverkar cellernas livskraft och dygnsrytm klocka. Den bandbaserade protoplasting metod 20 visualiseras här ger ett stort antal protoplaster; och med tanke på livskraften hos cellerna under en dygnstidsserie och den matchande periodlängder av protoplaster och hela plantor (tabell 2) är den metod som beskrivs här att föredra framför alternativa metoder för att generera protoplaster.Transfektion steget i protokollet är ett kritiskt steg som påverkar lönsamheten av protoplasterna. PEG-lösningen gör det möjligt för DNA som skall avges in i cellen, och båda inkubationstid i denna lösning (steg 3,4) och procentandelen av PEG bör bestämmas empiriskt. Standardkoncentrationen är 20%, med lägre koncentrationer minskar transformationseffektiviteten och högrekoncentrationer minskar lönsamheten 28. Inkubationstid så kort som fem minuter skulle kunna ge en effektiv transfektion av protoplasterna 27.
Protoplasterna kan avbildas på någon självlysande avbildning plattform. I den här filmen har vi använt en luminiscens plattläsare utrustad med externa lampor (röd och blå lysdioder, 630 och 470 nm, respektive, vid en kombinerad intensitet ~ 20 uE), som gör det möjligt för high-throughput screening och täta mätningar. Andra bildutrustning som detekterar luminiscens, såsom alternativa plattläsare eller inställningar uppbyggd kring en charge-coupled device (CCD) kamera, kan tillämpas lika bra så länge belysningen är tillgänglig för fotosyntes. Fördelen med att använda en CCD-kamera monterad på ett styrbart skåp är att ljus och temperatur kan programmeras. En nackdel är längre fånga tid, införa långa perioder av mörker som kan orsaka stress protoplastema förutom att störaing endogen tidtagning. Oavsett vilken experimentell plattform som väljs, kommer sannolikt att krävas jämfört med inställningar för plantor eller mogna växter justering av inställningar. I vår erfarenhet, kan öka koncentrationen av reporterplasmid under transfektion och / eller luciferin i bildbufferten lösa eventuella oregelbundna eller snabbt dämpande rytmer som kan uppstå i inledande experiment.
I framtida experiment, kan de metoder som beskrivs här tillämpas för att studera dygnsrytm fenotypen av någon mutant Arabidopsis linje. Med mindre modifieringar, kan effekten av t.ex. olika droger på tidtagning studeras i denna inställning. Dessutom kan transfektion modifieras till att innefatta artificiell microRNA för gen tysta 19, ytterligare utöka mångsidigheten av detta protokoll. Protokoll för att generera risprotoplaster är väletablerade 29 och bild Protokollet presenteras här kan även tillämpas för att främja vår understanding av klockan i ekonomiskt viktiga monokotyledona grödor.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
MES | Acros Organics | 327765000 | |
NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |