Mit Multi-fluorierten Bile Acids und<em> In Vivo</em> Magnetic Resonance Imaging Maßnahme Gallensäure-Transport

Summary

Werkzeuge Gallensäure – Malabsorption zu diagnostizieren und Gallensäuretransport in vivo messen begrenzt sind. Ein innovativer Ansatz in lebenden Tieren beschrieben , das kombinierte Proton ⁽¹ H) und Fluor ⁽¹⁹ F) Magnetresonanztomographie verwendet; Diese neuartige Methode hat translationale Potenzial für Gallensäure-Malabsorption in der klinischen Praxis zu screenen.

Abstract

Zusammen mit ihrer traditionellen Rolle als Reinigungsmittel, die Fettaufnahme zu erleichtern, gibt Literatur ab, dass Gallensäuren sind starke Signalmoleküle, die mehrere Organe betreffen; Gefäßtonus, Glukosestoffwechsel, den Fettstoffwechsel und Energieausnutzung sie modulieren Darm-Motilität und die Hormonproduktion und zu verändern. Änderungen in fäkale Gallensäuren können den Darm microbiome verändern und Kolon Pathologie einschließlich cholerrheic Durchfall und Darmkrebs zu fördern. Schlüsselregulatoren der fäkalen Gallensäure Zusammensetzung sind die kleinen Darm-Apikale Natrium-abhängigen Gallensäure-Transporter (ASBT) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor-19 (FGF19). Reduzierte Expression und Funktion von ASBT verringert Darm Gallensäure up-nehmen. Darüber hinaus kann di – vitro – Daten deuten darauf hin , dass einige der FDA zugelassene Medikamente ASBT Funktion hemmen. Defizienten FGF19 Freisetzung erhöht Lebergallensäuresynthese und Freisetzung in den Darm zu Ebenen, die ASBT überwältigen. Entweder ASBT Dysfunktion oder FGF19 Mangel erhöht fecal Gallensäuren und können chronische Durchfall verursachen und Kolon Neoplasien fördern. Bedauerlicherweise Werkzeuge Gallensäure – Malabsorption zu messen und die Aktionen von Drogen auf Gallensäuretransport in vivo sind begrenzt. Um die komplexe Aktionen von Gallensäuren zu verstehen, sind Techniken erforderlich, die die gleichzeitige Überwachung von Gallensäuren im Darm und metabolische Geweben ermöglichen. Dies führte uns eine innovative Methode vorstellen Gallensäuretransport in lebenden Tieren zu messen , eine Kombination von Protonen ⁽¹ H) und Fluor ⁽¹⁹ F) die Kernspintomographie (MRI) verwendet. Neuartigen Tracer für Fluor ⁽¹⁹ F) -basierte lebendes Tier MRI wurden erzeugt und getestet, sowohl in vitro als auch in vivo. Stärken dieses Ansatzes gehören die fehlende Belichtungsstrahlung und translationale Potenzial für die klinische Forschung und Praxis zu ionisieren.

Introduction

Zusammen mit ihren klassischen Rolle als Detergentien , die Fettabsorption aus dem Darm zu erleichtern, Gallensäuren wurden als potente Signalmoleküle beeinflussen mehrere Organe zusätzlich zu den mit den enterohepatischen Kreislauf ^1,2 zugeordnet entstanden. Zusätzlich zu ihren eigenen Stoffwechsel steuern, modulieren Gallensäuren mehrere Aspekte der gastrointestinalen Physiologie (zB Darmmotilität und incretin Hormonproduktion, Kolon Physiologie und Krebsanfälligkeit) und haben eine systemische Wirkung auf den vaskulären Tonus, Glukose- und Lipidstoffwechsel, und die Energienutzung. Während einige dieser Wirkungen im Darm vermittelt werden, sind andere aufgrund postprandial Veränderungen in systemische Spiegel Gallensäure, bei adipösen Patienten oder nach Magen-Bypass-Operation nicht anderweitig angegeben. Aufzuklären ist die komplexe metabolischen Wirkungen von Gallensäuren neue Technologie benötigt, die gleichzeitige Überwachung von Gallensäureniveaus in verschiedenen anatomischen Abteilen ermöglicht, im Gastrointestinaltrakt und metabolic Geweben (Leber, Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskulatur und Fettgewebe). Erhalten eines solchen zeitlichen und räumlichen Informationen erfordert innovative Technologie – di – vivo – Bildgebung neue Gallensäure – Tracer verwendet , wie hier beschrieben ist so ein neuer Ansatz.

Gallensäure Zusammensetzung und Verteilung in anatomischen Kompartimenten werden durch verschiedene Faktoren reguliert, die ihre hepatische Synthese und Ileum-Aufnahme modulieren, einschließlich Ernährung, Chirurgie, den Einsatz von Antibiotika und Veränderungen in der Darmflora. Ein wichtiger Regulator der intestinalen Gallensäureaufnahme für ihre enterohepatischen Kreislauf ³ (Figur 1) ist die Ileum – Apical natrium-abhängigen Gallensäure – Transporter (ASBT; SLC10A2). Obwohl passive Absorption in den Därmen stattfindet, vermittelt ASBT Aufnahme von 95% der intestinalen Gallensäuren, so dass normalerweise beschränkt Verschütten von Gallensäuren in die Faeces ist. ASBT-defizienten (Slc10a2 ^{– / -)} Mäusen haben fäkalen Gallensäuren und Gallen eine verminderte aci erhöhted Pool ^4.

Abbildung 1: enterohepatischen Kreislauf von Gallensäuren.
Illustration von enterohepatischen Kreislauf , wodurch Gallensäuren werden in der Leber gebildet schieden in den biliäre Baum, Stored in der Gallenblase, Veröffentlicht in den Proximal Duenndarm mit Mahlzeiten und aktiv über ASBT in distaler Ileum aufgenommen. Während geringe Mengen an Gallensäuren passiv ganzen Darm absorbiert werden, etwa 95% der intestinalen Gallensäuren resultierende im Stuhl in minimal (etwa 5%) Verlust aktiv durch ASBT transportiert, die durch eine ähnliche Menge an neuen Gallensäuresynthese kompensiert wird in die Leber, die Aufrechterhaltung dadurch eine Steady-State-Gallensäure-Pool. Die Pfeile auf der rechten Seite identifizieren Faktoren, die native und Fluor-markierten Gallensäurestabilität, einschließlich Magensäure, Bauchspeicheldrüsen- und Darmschleimhaut Enzyme auswirken können, und die meisten importantly, hydrolytische von Clostridien – Spezies freigesetzt Enzyme, die den distalen Dünndarm und Dickdarm besiedeln. (Mit Genehmigung ¹⁶⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Gallensäure-Malabsorption können in drei Typen eingeteilt werden, von denen jeder fäkalen dihydroxy Gallensäuren erhöht, wodurch eine intermittierende oder chronischen Durchfall. Typ 1 Ergebnisse von den Brutto – Ileum – Pathologie (zB Resektion, Morbus Crohn) ^5. Typ 3 Ergebnisse von Cholezystektomie, Vagotomie, Zöliakie, bakterielle Überwucherung und Pankreasinsuffizienz. Im Gegensatz dazu Personen mit "primären" (Typ 2) Gallensäure-Malabsorption stellen eine gewaltige diagnostische Herausforderung, weil sie solche Vorbedingungen fehlen und haben keine Beweise für Pathologie im Ileum. Daher wird primären Gallensäure-Malabsorption häufig als Durchfall-p falsch diagnostiziertredominant Reizdarmsyndrom (IBS-D), vielleicht der häufigste Grund für Gastroenterologie bezogene ambulante Besuche. Es hat sich gezeigt, dass mit IBS-D haben primäre Gallensäure-Malabsorption ein Drittel der Patienten geschätzt wird; in den USA kann dies mehrere Millionen Personen repräsentieren ^5. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die primäre BAM leitet sich von beeinträchtigten Feedback-Hemmung der Lebergallensäuresynthese durch Darm-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-19 (FGF19), nicht von einer verminderten Expression oder Funktion von ASBT.

Bei der primären Gallensäure – Malabsorption, versagen niedrige Plasmaspiegel von FGF19 Lebergallensäuresynthese abzusperren – das daraus resultierende Erhöhung der intestinalen Gallensäuren sättigt Gallensäure – Transporter, einschließlich ASBT und das vergrößerte Verschütten von Gallensäuren in den Kot verursacht Durchfall ⁶ (Abbildung 2). Defiziente Mäuse in Fgf15 (murine FGF19) haben eine Gallensäure Pool erweitert und erhöht fäkale Gallensäuren ^7.

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Abbildung 2: Die Mechanismen der intestinalen Gallensäure – Malabsorption.
Normalerweise , wie in Tafel A gezeigt ist , etwa 95% der intestinalen Gallensäuren werden durch aktiven Transport im distalen Ileum über ASBT absorbiert. Wenn ASBT Expression oder Aktivität vermindert (Feld B), Beeinträchtigung der Darmgallensäureaufnahme führt Verschütten von Gallensäuren in den Darm. Mit eingeschränkter FGF19 – Signalisierung (Panel C), das Fehlen von Feedback – Hemmung der Lebergallensäuresynthese führt zu einer erhöhten Konzentration von Darmgallensäuren , die ASBT Transportkapazität mit verschütteten Materialien von Gallensäuren in den Darm zu überwältigen. Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

Die langfristige, chronische Erhöhung in fäkale Gallen acids kann Kolon Neoplasien fördern. Colon Neoplasie ergibt sich aus progressiven Schleimhaut-Dysplasie mit somatischen Gen-Mutationen assoziiert, aber Umweltfaktoren, die fäkale Gallensäuren erhöhen kann diesen Prozess beschleunigen und zu erweitern. Bei Nagetieren erhöhten fäkalen Gallensäuren entweder als Folge der exogenen Verabreichung oder ASBT Mangel fördern colon Dysplasie und Tumorbildung ^8-10.

Bemerkenswert ist , provokativ Ergebnisse zeigen , dass häufig verwendete Medikamente , die von der Food and Drug Administration (FDA) genehmigt Gallensäuretransport durch ASBT in vitro ¹¹ potent inhibieren. Wenn diese Medikamente Dünndarm Gallensäuretransport in vivo und erhöhen fäkale Gallensäurespiegel zu senken, wäre die möglichen Auswirkungen auf die Kolon Pathologie betreffen. Selbst ein kleiner Anstieg der Kolon Pathologie zurückzuführen eines solchen Arzneimittels zu verwenden, könnte eine große Auswirkungen auf die Gesundheit haben. Ein Toolkit, das die Plausibilität dieser di – vitro – Ergebnisse und epidemiologischer ob beurteilenachtungen würde zusätzliche Forschung anspornen, einschließlich Post-Marketing-Studien zur Sicherheit.

Trotz der Notwendigkeit, die praktische Tests identifizieren Menschen mit Gallensäure-Malabsorption fehlen. Eine direkte Messung der fäkalen Gallensäuren wurde Jahre abgelehnt vor als umständlich, unpraktisch und unzuverlässig ^5. Alternative Ansätze umfassen die Messung Beibehaltung einer radioaktiven Selen-markiertem Cholsäure – Derivat ⁽⁷⁵ SeHCAT) und die Plasmaspiegel von 7α-Hydroxy-4-cholesten-3-on (C4) oder einem Therapieversuch von Gallensäurebinder. ⁷⁵ SeHCAT Tests haben begrenzte Verfügbarkeit in Europa und ist nicht FDA-zugelassen oder für den Einsatz in den USA Außerdem, selbst bescheidene Strahlenexposition (0,26 mSv / ⁷⁵ SeHCAT Test) von diagnostischen Tests wirft Bedenken, und bakterielle Überwucherung und fortgeschrittener Lebererkrankung kann ⁷⁵ SeHCAT Ergebnisse durcheinander bringen. C4-Test ist potentiell attraktiv, da nur Plasma erforderlich ist, aber es hat eine geringe positive prädiktive value und Prüfung ist nicht weit verbreitet. Messung der Serumspiegel von FGF19 hat ähnliche Grenzen. Häufig greifen Ärzte auf ein Therapieversuch von Gallensäurebindern, aber dieser Ansatz kann eine endgültige Diagnose von Gallensäure – Malabsorption ⁵ nicht zur Verfügung stellen.

Aus diesen Gründen wurde ein neuartiges MRI – Ansatz konzipiert Gallensäure Transport und die Verteilung in vivo unter Verwendung von innovativen Multi-fluorierten Gallensäuren (MFBA-MRT) messen. MFBA drei Atome von Fluor ⁽¹⁹ F), einem stabilen Isotop von 100% natürlicher Häufigkeit enthält, werden ähnlich zu nativem Gallensäuren ^12, transportiert und verwendet werden kann , um Gallensäure – Transport mit einer Kombination von Protonen ⁽¹ H) und Fluor visualisieren ( ¹⁹ F) MRT, ein sensibles, sicheres Verfahren ohne Strahlenbelastung ionisierender ^13,14.

Protocol

Das folgende Protokoll hält sich an Richtlinien durch die Pflege und Verwendung Committee (IACUC) an der University of Maryland School of Medicine (IACUC Protokoll # 0415011, den 18. Juni genehmigt, 2015) Institutional Animal genehmigt. 1. Gavaging Mäuse , die mit 19 F-markierten Bile Acids Gavage Mäuse mit 150 mg / kg Körpergewicht 19 F-markierten Gallensäuren. Füllen einer 1-ml Spritze mit dem erforderlichen Volumen mit 19 F-markierten Gallensäure – Stammlösu…

Representative Results

Die Verwendung von MFBA für in vivo – MRT zu "sehen" Gallensäuretransport in Echtzeit hat ein großes Potenzial für die Forschung und die klinische Anwendung. Außerdem beschriebenen Verfahren hier zur Resektion der Gallenblase und biochemische Analyse seines Inhalts unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ein Mittel zur Bildergebnisse bestätigt. Jedoch erfordert die Gültigkeit dieser Verfahren eine genaue Dosierung, Timing von As…

Discussion

Die Synthese von CA-lys-TFA und CA-sar-TFMA und die di – vitro – Analyse der Transport stabil transfizierten Madin-Darby – Hundenierenzellen unter Verwendung von ASBT und humane embryonale Nierenzellen exprimieren , die Expression des Natrium / taurocholate Co-Transport Polypeptid (NTCP) werden an anderer Stelle ^13,14 detailliert beschrieben. Hier liegt der Schwerpunkt auf die orale Verabreichung von MFBA mit der Schlundsonde Tiere leben, gefolgt von der Ernte der Gallenblase, Leber und Blut…

Materials

Duall size-21 all glass tissue grinder	Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ	885351-0022
Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner	Bruker Biospin MRI GmbH, Germany		Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil	Bruker Biospin MRI GmbH, Germany		Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector	Waters Corporation, Milford, MA
Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 X 50 mm column	Waters Corporation, Milford, MA
Gavage Needle	Braintree Scientific, INC.	N-010	20 G-1.5" curved 2.25mm ball
2 Stainless Steel Hemostats	VWR	10755-018	4 and 5 inch, straight
Ketamine	MWI Veterinary Supply	501090	Ketamin zetamine 100 mg / ml
Xylazine	Akorn, Inc.		20 mg/ml
Intraperitoneal Catheter	Abbott	AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42	24-G x 0.75"