In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.
Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.
Fosterdiagnostikk er et viktig klinisk verktøy for å evaluere genetiske sykdommer (dvs. kromosomavvik, monogenetic eller polygenetisk / multifaktoriell sykdommer) og medfødte misdannelser (dvs. medfødt diafragma brokk, cystisk lungelesjoner, exomphalos, gastroschise). Fostervann (AF) celler er enkle å få tak i fra rutinemessig fastsatte prosedyrer i andre trimester av svangerskapet (dvs. fostervannsprøve og amnioreduction) eller keisersnitt 1, 2. Tilgjengeligheten av AF-celler fra prenatal eller nyfødte gir mulighet for å bruke denne kilde for regenerativ medisin, og flere forskere undersøkt muligheten for å behandle forskjellige vev skader eller sykdommer ved hjelp av en stilk cellepopulasjon isolert fra AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Muligheten for lett å skaffe AF-celler fra syke pasienter, etter et tidsvindu der sykdommen er ofte stasjonær, åpner veien til ideen om å bruke denne celle kilde for omprogrammering formål. Faktisk kan induseres pluripotent stammen (IPS) celler avledet fra AF-celler differensieres i cellene av interesse for in vitro legemiddeltesting eller vev for tekniske fremgangsmåter, for å fremstille en tilfredsstillende pasientspesifikk behandling før fødsel. Mange studier har allerede demonstrert evne til AF-celler til å være nytt og differensiert i et bredt spekter av celletyper 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.
Siden oppdagelsen av Takahashi og Yamanaka 28 av omprogrammerte somatiske celler gjennom tvungen uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer (Oct4, Sox2, cMyc og Klf4), er det gjort framgang innen omprogrammering. Tatt i betraktning de ulike metoder, kan vi skille mellom viral og ikke-virale tilnærminger. Den første forventer at bruken av virale vektorer (retrovirus og lentivirus), som har høy virkningsgrad, men vanligvis er ufullstendig stanse av den retrovirale transgenet, med både er konsekvensen av en delvis omprogrammeres cellelinje og risiko forinsertional mutagenese 29, 30, 31. Den ikke-viral metoden bruker ulike strategier: dvs. plasmider, vektorer, mRNA, protein, transposoner. Avledning av iPS celler uten transgene sekvenser tar sikte på å omgå de potensielt skadelige effektene av utett transgene uttrykk og insertional mutagenese. Blant alle de ovennevnte ikke-virale strategier, krever PiggyBac (PB) transposon / transposase-systemet bare de inverterte terminale gjentakelser flankerende et transgen og forbigående ekspresjon av transposase enzym for å katalysere innsetting eller eksisjons- hendelser 32. Fordelen ved bruk av transposoner i forhold til andre fremgangsmåter for IPS celle generasjon er muligheten for å oppnå vektorfrie iPS-celler med en ikke-viral vektor tilnærming som viser den samme effektivitet av retrovirale vektorer. Dette er mulig ved spor mindre fjerning av den integrerte transposon som koder for reprogramming faktorer etter en ny forbigående uttrykk for transposase i iPS celler 33. Gitt at PB er effektiv i forskjellige celletyper 34, 35, 36, 37, er mer egnet for en klinisk tilnærming med hensyn til virale vektorer, og gjør det mulig for produksjon av Xeno-fri iPS celler i motsetning til dagens viral produksjon protokoller som bruker xenobiotisk betingelser, blir dette systemet anvendt for å oppnå iPS celler fra murin AF.
Her foreslår vi en detaljert protokoll etter allerede publiserte arbeider for å vise produksjonen av pluripotente iPS kloner fra mus AF celler (iPS-AF celler) 38.
Den velges for å oppnå den induksjon av pluripotency metode er relevant for celle kliniske sikkerheten med hensyn til langtids transplantasjon. I dag finnes det flere metoder som er egnet for omprogrammering. Blant de ikke-integrerende metoder, er Sendai viral (SeV) vektor et RNA-virus som kan produsere store mengder protein uten å integrere inn i kjernen av de infiserte celler 40 og kan være en strategi for å få iPS-celler. Sev vektorer kan være en attraktiv kandidat for generering av tra…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children’s Charity.
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1X |
Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1X |
Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1X |
Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
Insulin syringe with needle (25G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1X |
NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1X |
Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
PBS 10X | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1X |
Penicillin – Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Petri Dish (150mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | – | mPBase |
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | – | PB-tetO2-IRES-OKMS |
QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | – | rtTA |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1X |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1X |
αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
200 ul tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |