Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים לקבל ולהעביר קלט סינפטי, פוטנציאל פעולה תמיכה לאחור-לריבוי שחרור הנוירוטרנסמיטר. הבנת פונקציות בסיסיות אלה ישפכו אור על העברת מידע בנוירונים אלה. קלטות תיקון- clamp דנדריטים לספק את האפשרות לבחון את התכונות החשמליות ישירות של דנדריטים תעלות יוני מתח מגודר בסיסיות. עם זאת, מבנים בסדר אלה אינם נגישים בקלות טפטפות תיקון בגלל הקוטר הקטן שלהם. דו"ח זה מתאר צעד אחר צעד הליך כדי לאסוף הקלטות יציבות ואמינות מן דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים פרוסים חריף. מדידות אלקטרו משולבות עם התאוששות פוסט הוק של מורפולוגיה תא. ניסויים מוצלחים להסתמך על הכנת שיפור של פרוסות, פתרונות טפטפות, התאמה נאותה של אופטיקה והיציבות של פיפטה במגע עם המבנה המוקלט. עקרונות תקן של סוםהקלטת תיקון- clamp atic מוחלת דנדריטים אבל עם גישה מתונה יותר של פיפטה. טכניקות צדדיות אלו יכולות להיות מיושמות על מנת לענות על שאלות שונות לגבי הנכסים להתרגש של דנדריטים.
נוירונים לקבל מידע הסינפטי בעיקר על הדנדריטים שלהם. מעורר אותות הסינפטי מעכבים להפיץ מהאתר שלהם של דור לאתר האינטגרציה שבו פוטנציאל פעולה (APS) הם עוררו את אות המוצא. בדרכם, פוטנציאלים הסינפטי מושפעים הוא מבחינת המבנה של דנדריטים האינטראקציה בין תכונות הממברנה פסיביות ואקטיביות. השילוב של פרמטרים משתנים מאוד אלה מרחיב את כוח החישוב של נוירונים 1,2. עם זאת, הקוטר הקטן של דנדריטים מעכבים אולם המחקר של התכונות החשמליות שלהם. הפיתוח המתמיד של טכניקת תיקון- clamp 3, אופטיקה 4 והעידון של שיטות להכנת פרוסה 5 במהלך העשורים האחרונים אפשרו הקלטות מן דק מאוד (0.7 – 3 מיקרומטר O) דנדריטים 6,7. שיטות אלה היו, והם, עדיין במידה רבה להשתמש כדי לבחון את הרגישות של דנדריטים במגוון of נוירונים 8. קלטות הדנדריטים ישירות חיוניות כדי לקבוע את החלוקה 9-19 ו הבדלים בתכונות הפונקציונליות 20-22 של תעלות יונים בתאים עצביים ברורים. נתונים אלו הם משלימים ההכרחיים של הפצות ערוץ יון מזוהות עם אימונוהיסטוכימיה בשילוב מיקרוסקופ אור האלקטרונים 23,24. קלטות somatodendritic Dual יושמו לחקור את התפשטות פוטנציאל פעולה 9,13-15,21,22,25-27 והפצת פוטנציאלים הסינפטי 13,16,18 לאורך תחום somatodendritic של נוירונים, להשיג דגמי כבל פסיביים מפורטים 28. 30 ולחקור ההחלטה הזמנית של אינטגרציה עצבית 31.
Nigra substantia (SN) הוא אזור הממוקם במוח התיכון מעורב בכמה פונקציות כגון שליטה על תנועה, הקידוד של גמול והתנהגויות רגילות. הירידה של דופמין עקב אל הפרטאובדן דופאמין (DA) נוירונים SN קשור הפרעות המוטוריות אצל חולים הסובלים ממחלת פרקינסון 32. מעגל nigral מורכב משני סוגי תאים עיקריים: נוירונים דופאמינרגיים GABAergic. מעניין, הנוירונים האלה יש כמה תכונות ספציפיות המבדילות אותם נוירונים אחרים. האקסון של חלק גדול של נוירונים DA וכמה נוירונים GABA מקורו מאתר הדנדריטים המציין כי סוכת הדנדריטים היא הטרוגנית (האקסון נושאות דנדריטים-חסר האקסון) 25,26,33. המורפולוגיה של נוירונים אלה ניגודים ולכן עם בארגון טיפוסי של נוירונים שבו העברת מידע בהתאם לחוק של קיטוב דינמי הנפלטת קחאל: החל דנדריטים, כדי סומה ולבסוף האקסון 34. נוירונים DA ידועים גם לשחרר דופמין מן הדנדריטים שלהם 35, ליצור פעילות התפוצצות 36 הפלסטיות NMDA קולטן 37. dissection של תופעות אלה הוא חמקמק ללא הקלטות ישירות מהאתר שבו הם יזמו. כדי לקבל תובנה לתוך הקשר בין המיקום המדויק תכונות פעילות של תעלות יונים ותפקידם העברת הרגישות ומידע הדנדריטים בנוירונים nigral, קלטות הדנדריטים ישירות הן את שיטת בחירה.
דו"ח זה מתאר הליך מפורט, שניתן להשתמש בם כדי להשיג הקלטות יחידות כפולות תיקון- clamp מ דנדריטים של נוירונים nigral ואת תיוג biocytin פוסט הוק המקביל. העקרונות הבסיסיים עבור תיקון והגופני ואת קרום הדנדריטים הם מאוד דומים. למעשה זאת, הקלטות מאתרים הדנדריטים דורשות אופטימיזציה ספציפית בהשוואה להקלטות סומטיים. קלטות הדנדריטים מוצלחות לסמוך על האיכות של הפרוסות, התאמה אופטימלית של אופטיקה, גישה עדינה של פיפטה את התיקון והיציבות של ההקלטות.
דו"ח זה מתאר פרוטוקול צעד אחר צעד ליישם קלטות somatodendritic כל תא כפולות וקלטות הדנדריטים מקומיות. זה שימושי לקביעת ההשפעה של תעלות יונים (כלומר, אני ח) על מהלך הזמן של הפוטנציאלים postsynaptic ומיפוי חלוקת ערוץ יון (אני ח) לאורך תחום somatodendritic של נוירונים DA nigral, בהתאמה. כתוצאה מדידות אלקטרו משולבים כדי לפרסם הוק היסטוכימיה להתאושש מורפולוגיה התא. ההליך הועסק לחקור נוירונים DA ממוקמים nigra substantia, אבל ניתן להכליל עבור נוירונים GABA nigral שכנות, נוירונים DA הטגמנטום הגחוני או נוירונים מוח תיכונים אחרים. כל השלבים ניתן בעקבות לבחון גם תעלות יונים אחרים הביעו דנדריטים של נוירונים nigral בלי שינויים חשובים. הוק הודעה להדמיה הוא רלוונטי במיוחד עבור נוירונים עם נושאות האקסוןדנדריטים, כגון נוירונים nigral 25,26, interneurons oriens-alveus בהיפוקמפוס 21 או כמה עצב פירמידליים CA1 67. מעניין לציין, כי נוירונים שיתוף תכונה זו נראה יותר נפוץ ממה שמקובל לחשוב 67. ניתוח מורפולוגי חושף גם את המיקום המדויק של האלקטרודות האקסון. הגילוי של זה האחרון עשוי להיות מותאם על ידי התיוג של חלבונים הביעו במגזר הראשוני האקסון (ערוצי Na + מתח מגודר או Ankyrin G) באמצעות אימונוהיסטוכימיה 68,69.
מהימנותם של נתונים שנאספו עם קלטות הדנדריטים וסימון עצבי עוקב תמיד תלויה באיכות הפרוסה. מאמץ מקסימאלי צריך אפוא להיות מיושם כדי לשמר את הכדאיות של תאים בתוך הרקמה. זו מושגת באמצעות טיפול עדין של בעלי חיים בריאים, כלים איכותיים ריאגנטים, חמצון מספיק של טמפרטורות הרקמות קרות כקרח לאורך כל הכנת פרוסות. תנאי הקלטה יציבים להסתמך על הבחירה של נוירונים בריאים. במצב כל התא, התנגדות סדרה צריכה תחילה להיות נמוכה ככל האפשר ומתוחזק קבועה לאורך כל הניסוי. היציבות של הקלטות היא עוד תלויה מניפולטורים באיכות גבוהה נטול להיסחף ותנודות. ניתן להפחית הפרעות אלו על ידי אופטימיזציה של יציבות פיפטה: בדיקת החיבור לבעל פיפטה וכדי headstage, שליטה שכבלי micromanipulator מופשלים, הימנעות שינויים פתאומיים בטמפרטורה או תנועה הבמה לבדיקת המנגנון של המניפולטור. עבור הקלטות כפולות, methylsulfate 13,15,21 נכלל הפתרון התאי, אבל גלוקונאט 9,14,25 יכול להיות מועסק לסירוגין. עם זאת, האניון העיקרי עשוי לשנות את קרום פוטנציאל 70,71 וכמה זרמים תלויי מתח 72. פתרון תאי ניתן להשלים עם ATP, GTP ו phosphocreatine לשמר את physioloפונקציות gical של נוירונים. בנוסף, הוספת צבע פלואורסצנטי בפתרון פיפטה (למשל, Alexa 594 או Sulforhodamine 101 41) כדי להמחיש את דנדריטים במהלך ההקלטה סומטיים יכול להיות שימושי למשל להציב יישום הלחץ (איור 7 נ"צ. 41) או מגרה חשמל פִּיפֵּטָה. הפתרון פיפטה להקלטות מצורפות תא מכיל ריכוז גבוה K + ואין Na + להקליט ח ט גדול. ראוי לציון יחס ריכוז Na + / K + משפיע על משרעת הנוכחית 10, פוטנציאל ההיפוך של 11 הנוכחי ואת gating של אני ח 73. לחלופין, אני ח יכול גם להקליט באמצעות מחוץ-outs 10. בתצורת הקלטה זו אולם, המילייה התאי הקרבה של הערוצים עשוי להיות מוטרד. כתוצאה מכך, הבדלים הפעלה תלוי המתח של לי <sub> h הוא ציין כאשר זרמי השוואה שהושגו באמצעות טלאים מצורפי תא ומחוץ-outs 10. נפיחות של נוירונים הוא נתקל מדי פעם במהלך ההקלטה תיקון- clamp, ולעתים קרובות מתעוררת מגורמים ברורים, כגון איכות נמוכה של מים, חוסר איזון חזקה osmolarity או pH בין התוך ואת הפתרונות תאיים 39 או טעויות בהרכב של פתרונות. איכות הקלטות אלקטרו יש שכיחות ישירה על איכות המורפולוגיה של נוירונים התאושש. טפטפות סומטיים עמידות גבוהה משמשות להקלטות כפולות (6 – 10 MΩ, כמו שופטים 6,11.) ו להקלטות סומטיים אחת אחרי הקלטות מצורפות תא כדי למזער את הדילול של המילייה התאית 14. ההקלטה סומטיים כל התא בעקבות הקלטת התא מצורף ולכן הוא כל זמן קצר (<10 דקה '). בחוץ-אאוט תיקונים משני טפטפות סומטיים הדנדריטים חיוניים סגירה תקינה של גell קרום וההתאוששות הבאה של מורפולוגיה התא. בנוסף של מבנה התא, התוכן הנוירוכימיים עשוי להיקבע על נוירונים רשמו 59,74. למשל, hydroxylase החלבון טירוזין תאיים ניתן immunolabeled לזיהוי חד-משמעי של נוירונים DA 13.
נוירונים DA מרוכזים בעיקר SN pars compacta, עם צפיפות נמוכה בהרבה נוכח SN pars reticulata, שם הם מתערבבים עם מספר גבוה יותר של נוירונים GABA 75. בעוד גוף התא של הנוירונים DA הוא לעיתים קרובות גדול יותר מזה של נוירונים GABA, זיהוי חזותי של תאים אלה עם IR-videomicroscopy אינה ודאית הפריע חלקית את אטימות compacta pars. כדי לעקוף מגבלות אלו, הבחירה מראש של נוירונים DA ניתן להקל על ידי השימוש של עכברים מהונדסים המבטא בסמן פלורסנטי באוכלוסייה ספציפית של נוירונים (TH 65 או DAT נוירונים DA, GADעבור נוירונים GABA) ואת התאורה epifluorescence. לחלופין, פלורסנט לצבוע עשוי להיכלל הפתרון של האלקטרודה סומטיים כדי להקל על ויזואליזציה של דנדריטים. רזולוציה מוגברת של התא פלורסנט מובא על ידי confocal דיסק מסתובב ניפקוב 14,22,30 או שני הפוטונים מיקרוסקופיה 7 בשילוב IR-DGC 6. כמה יתרונות קשורים DGC בהשוואת דסק"ש. ראשית, כפי מנסרות דסק"ש אינן נדרשות, תמונת IR-DGC ניתן ועליהן 49,52,53,76 תמונת קרינה. שנית, DGC ניתן לשלב עם photostimulation ו optogenetics 77.
חסרון של הכנת פרוסה הוא השמירה על השלמות של נוירונים. נוירונים DA להאריך הדנדריטים שלהם בשלושת המטוסים מרחבית 78,79 ולכן עיצור של תא הדנדריטים לא ניתן להימנע לחלוטין פרוסות 80. הבחירה של האורינטציה של פרוסות (עטרה, אופקי או פסקsagittal) היא trade-off. מקורו של העצבוב ואת תכנון הניסוי חייב להיחשב כדי לבחור את כיוון הזכות פרוסה.
תיקון הדנדריטים ישיר הוא הטכניקה המשמשת כדי למפות את התפלגות תעלות יונים פונקציונליות במדורים השונים של תאים. בנוסף, טכניקה זו מציעה לקבוע את השתנות תכונות פעילות של ערוצים 20. כהשלמה המיקום וצפיפות של תעלות יונים ניתן לקביעה באמצעות אימונוהיסטוכימיה על מיקרוסקופ אור ואלקטרוניקה רמות 17,23. גישה זו גם מציעה את האפשרות לקבוע את צפיפות הערוץ במבני קליבר קטנים אשר אינם נגישים טפטפות תיקון. עם זאת ערוצים אלה עשויים להיות במצב תפקודי ברור 24 או אפילו פעילים בהשוואה לאלו אשר נרשמו באמצעות טכניקות תיקון- clamp. טכניקות שניהם לכן, יש לקבל תמונה מלאה על המיקום והמאפיינים שלתעלות יונים באזור תאי ספציפי 17. עם התפתחותה של צבעים מתח רגיש, הדמיה מתח נעשה שימוש כדי לבחון את התפשטות של APS ו EPSPs בנוירונים במקומות מרובים 81. כחלופה להקלטות תיקון- clamp כפולות, גישה זו ניתן ליישם גם עבור דנדריטים דק שאינם נגישים טפטפות תיקון אבל מחייבים כיול מדויק של האות ו המיצוע.
בעוד נוירונים DA ב SN ואזור tegmental גחון נחקרים נרחב באמצעות הקלטות סומטיים בהקשר הפיזיולוגי pathophysiological, את המאפיינים התפקודיים של הדנדריטים שלהם נותרים עלומים בעיקר בשני התנאים. תיקון מ דנדריטים יושם עבור נוירונים דופמין nigral על ידי מספר קבוצות עם הצלחה 13,25,26 ונשאר שיטת הבחירה לנתח תכונות להתרגש מבני subcellular בסדר אלה 8. הקלטות דנדריטים לספק opportu נוסףnity לבחון את היעילות ואת הפלסטיות של שידור הסינפטי פלסטיות של רגישות הדנדריטים 82,83.
The authors have nothing to disclose.
אני מודה ד"ר וינסנט Seutin בתמיכה המתמשכת שלו, Christelle Gillissen ולורן Massotte לקבלת סיוע טכני מעולה, ד"ר ז'אן Defourny וסנדרה Ormenese עבור עצות עם מיקרוסקופ confocal, ד"ר ז'אק ארגנה על המתנה של מגבר Axopatch 200B השני, הדמית GIGA פלטפורמה לשיתוף המיקרוסקופ confocal ותוכנת Imaris וד"ר סטיבן פרימן לקריאת כתב היד באופן ביקורתי. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של FRS בלגי – FNRS (U.N002.13 ו T.N0015.13) ופורסם בתמיכת קרן אוניברסיטת הבלגית (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |