À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
Métastase vers des sites secondaires , tels que le poumon, le foie et l' os est un événement traumatique avec un taux d'environ 1 à 90% de mortalité. Parmi ces sites, le poumon est le plus difficile à évaluer en utilisant l'imagerie optique intravitale en raison de sa position fermée dans le corps, la nature délicate et rôle vital dans le maintien de la physiologie appropriée. Bien que les modalités cliniques (tomographie par émission de positons (TEP), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomodensitométrie (CT)) sont capables de fournir des images non invasives de ce tissu, ils manquent de la résolution nécessaire pour visualiser les premiers événements d'ensemencement, avec un seul pixel constitué de près d'un millier de cellules. Les modèles actuels de poumon métastatique ensemencement postulat que les événements juste après l'arrivée d'une cellule tumorale déterministes pour la survie et la croissance ultérieure. Cela signifie que en temps réel des outils d'imagerie intravitale avec une résolution à une seule cellule 2 sont nécessaires pour définir les phénotypes de l'ensemencement cells et de tester ces modèles. Alors que l' imagerie optique à haute résolution du poumon a été réalisée en utilisant divers ex vivo des préparations, ces expériences sont généralement seule fois-point des tests et sont sensibles à des artefacts et des conclusions erronées possibles en raison de l'environnement considérablement modifié (température, profusion, cytokines, etc. ) résultant de la suppression de la cavité thoracique et le système circulatoire 3. Des travaux récents ont montré que l' imagerie optique intravitale time-lapse du poumon intact est possible en utilisant un vide stabilisé fenêtre d'imagerie 2,4,5 cependant, les temps typiques d'imagerie ont été limités à environ 6 heures. Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une imagerie intravitale time-lapse à long terme du poumon en utilisant une telle fenêtre sur une période de 12 heures. Les time-lapse séquences d'images obtenues à l'aide de cette méthode permettent la visualisation et la quantification des interactions entre les cellules, la dynamique des membranes et de la perfusion vasculaire dans les poumons. Nous avons en outre dEscribe une technique de traitement d'image qui donne une vue sans précédent claire de la microvascularisation pulmonaire.
Introduction
L'imagerie haute résolution optique intravitale est avérée être essentielle à la compréhension de nombreux processus biologiques, ce qui permet une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaires qui doivent être mesurés et quantifiés. Dans la recherche sur le cancer, l' imagerie intravitale de cellules tumorales et stromales a conduit à la découverte de nombreuses interactions microenvironnementales 6-11 qui ne sont présents que chez l'animal intact.
Les découvertes sur microenvironnements associés à intravasation et la diffusion des cellules tumorales dans le cancer du sein par imagerie optique à résolution cellulaire unique in vivo a même conduit à de nouveaux marqueurs pour le pronostic et la réponse au traitement chez les patients atteints de cancer du sein 12-16. Les meilleures technologies d'imagerie disponibles pour la visualisation profondément dans les organes vitaux internes intacts sont les modalités cliniques (IRM, PET, CT) qui offrent d'excellentes vues de l'organe entier et peut révéler des pathologies avant même qu'ils produisent des symptômes cliniques. Ils sont incapables, houtefois, pour révéler les premiers stades de la métastase et les mécanismes cellulaires de conduite progression de la tumeur en raison de leur manque de résolution de la cellule unique. Au moment où les métastases pulmonaires sont visibles dans ces modalités, elles sont bien établies et la prolifération. Compte tenu de l'estimation selon laquelle 90% des cellules disséminées tumorales qui arrivent dans le poumon soit ne survivent pas à 17 ou initialement restent dormantes 18, et l'observation selon laquelle ils arrivent beaucoup plus tôt que prévu 19, imager les premières étapes de l' arrivée et la survie devient crucial de comprendre le processus d'ensemencement métastatique et la récurrence de la croissance tumorale sur des sites distants.
L'exécution de ces observations dans le poumon a prouvé cependant extrêmement difficile; la grande majorité des études d'imagerie ont utilisé ex vivo ou explants préparations 20-23, qui ne donnent une vue dans le poumon à des moments uniques. Bien que ces préparations fournissent des informations utilesrmation, ils ne donnent pas une compréhension complète des interactions, des relations de cause à effet, et la dynamique qui se produisent entre les diverses composantes du microenvironnement. L'absence d'un système adéquat circulatoire (et le déséquilibre concomitant de l' homéostasie) et la déconnexion du reste du système immunitaire de l'organisme, il est désireux de valider les conclusions que ces préparations génèrent dans le tissu intact in vivo.
De nombreux groupes ont effectué l' imagerie intravitale du poumon intact 2,4,5,24-33 avec Wearn et l' allemand étant le premier à chirurgicalement exposer la couche pleural 24 et Terry le premier à utiliser une fenêtre d'imagerie implantable 25.
imagerie à haute résolution dans le poumon est fortement entravée par le mouvement constant du poumon et plusieurs techniques ont été développées pour surmonter cette limitation. Wagner et Filley 27 ont étudié le mouvement naturel du poumon canineet conçu leur protocole chirurgical pour localiser leur fenêtre implantée sur une région relativement stationnaire tandis que Wagner a utilisé le vide dans sa fenêtre préparation chirurgicale pour immobiliser le tissu 28. Depuis ce temps, une variété de techniques ont été utilisées pour l' image du poumon , y compris: serrage des bronches, l' apnée séquentielle et imagerie fermée, acquisition suréchantillonné, collage du lobe du poumon et de vide 34. Chacun d'eux a ses avantages et ses inconvénients et pas une technique est apparue comme supérieur à un autre 34. Par exemple, la bronche de serrage et de l'apnée séquentielle modifie l'échange normal de gaz dans les poumons et peuvent provoquer une atélectasie. imagerie Gated et l'acquisition suréchantillonné ne souffrent pas de ces inconvénients, mais exigent à grande vitesse ou des équipements spécialisés d'imagerie pas largement accessible. Enfin, tant encollage du poumon et de la technique du vide éviter les deux inconvénients mentionnés ci-dessus, mais peuvent présenter des lésions induites par la force de cisaillement si les soins ne sont pas taken. Au cours des dernières années, la fenêtre de vide a été miniaturisé et adapté pour une utilisation dans des souris en utilisant confocale et multiphotonique microscopie 4,5,33 et une excellente imagerie à haute résolution a été atteint 2. Le tableau 1 résume cette riche histoire et met en évidence ces documents qui décrivent roman les progrès dans l'utilisation de fenêtres d'imagerie intravitale du poumon.
Ce protocole décrit l'utilisation de longue time-lapse multiphotonique intravitale microscopie à l'image des métastases dans le, du poumon intact en direct avec la résolution subcellulaire le plus élevé possible. Les images sont acquises pour un maximum de 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé d'une ouverture numérique objectif élevé et tube photomultiplicateur multiple (PMT) détecteurs. des modèles de souris transgéniques sont utilisés pour l'étiquette fluorescente macrophages natifs avec fluorescent dextran de poids moléculaire élevé et des cellules tumorales de protéines fluorescentes transfectées (pour marquer les cellules tumorales du système vasculaire et respectively). Bien que ce choix de cellules marquées par fluorescence permet la visualisation des interactions cellulaires-macrophage cellules endothéliales tumorales et la dynamique, ce protocole va travailler pour toute souche de souris fluorescent ou non fluorescent. Après l' acquisition, le mouvement de dérive résiduelle ( le cas échéant) est éliminé en utilisant un plug – in Fiji 35,36 et macros personnalisées moyenne temporelle du canal vasculaire pour éliminer le clignotement provoquée par des cellules non marquées du sang circulant.
Bien que ce protocole met l'accent sur l'imagerie des métastases, les techniques sont applicables à de nombreux autres processus biologiques observables avec imagerie à haute résolution à cellule unique dans le poumon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Haute résolution en imagerie optique in vivo combinée avec des étiquettes fonctionnelles marquées par fluorescence tels que des protéines et des anticorps a augmenté de façon spectaculaire notre compréhension de la cascade métastatique. Elle a permis la visualisation directe et la quantification d'une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaire dans les cellules tumorales, des cellules hôtes et leur microenvironnement. Cette imagerie au sein de la tumeur primaire a conduit, par ex…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
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