진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
이러한 폐, 간, 뼈 등의 보조 사이트에 전이가 약 90 % 1의 사망률과 외상 이벤트입니다. 이러한 사이트 중 폐 인해 몸, 섬세한 자연과 적절한 생리 유지에 중요한 역할 내에서 밀폐 된 위치로 생체 내에 광학 영상을 사용하여 평가하기가 가장 어렵다. 임상 양상 (양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 컴퓨터 단층 촬영 (CT)이)이 조직의 비침 이미지를 제공 할 수있는 반면, 한 번의 픽셀과 초기 시드 이벤트를 시각화하는데 필요한 해상도를 결여 거의 천 세포로 구성. 단지 종양 세포의 도착 후 이벤트가 생존과 이후의 성장에 결정적 전이성 폐 시드 가정의 현재 모델. 이 단일 세포 분석이 실시간으로 생체 내에 이미징 도구 시딩 CEL의 표현형을 정의하기 위해 필요하다는 것을 의미LS는이 모델을 테스트합니다. 폐의 고해상도 광학 영상은 다양한 생체 제제를 사용하여 수행되었지만, 이러한 실험은 전형적으로 단일 시간 시점 분석하고 (인해 대폭 변화된 환경 온도 풍부, 사이토 카인 등 아티팩트 가능한 잘못된 결론에 취약 ) 흉강 및 순환 시스템 3에서 제거한. 최근 작품은 진공 그러나 영상 창 2,4,5 안정화 사용 가능한 그대로 폐의 시간 경과 생체 내에 광학 영상입니다 보이고있다 일반적인 영상 시간은 약 6 시간으로 제한되어있다. 여기에서 우리는 12 시간의 기간에 걸쳐 이러한 윈도우를 이용한 폐의 장기간 생체 내에 촬영 된 영상을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법을 사용하여 얻어진 시간 경과 이미지 시퀀스는 폐의 시각화 및 세포 – 세포 상호 작용의 정량, 막 역학과 혈관 관류 수 있습니다. 우리는 더 라폐의 미세 혈관의 전례 명확한 도면을 제공하는 영상 처리 기술을 방접원을 그리다.
Introduction
고해상도 생체 내에 광학 영상은 단일 셀 및 하위 세포 매개 변수 측정 및 정량화 될 수 있도록 다수의 생물학적 과정을 이해하는데 중요한 것으로 입증되었다. 암 연구에서, 종양 및 기질 세포의 생체 내에 영상은 그대로 동물에만 존재하는 많은 미세 환경의 상호 작용 6-11의 발견하게되었다.
생체 내에서 단일 세포 해상도 광학 영상을 이용하여 유방암 intravasation 및 종양 세포의 보급과 관련된 미세 환경에 대한 발견은 심지어 예후 유방암 환자의 12-16 치료에 대한 반응에 대한 신규 마커하게되었다. 그대로 내부 중요한 장기 내에서 깊은 볼에 사용할 수있는 최고의 영상 기술은 전체 기관의 뛰어난 전망을 제공하고 임상 증상을 생산하기도 전에 병리을 표시 할 수있는 임상 양상 (MRI, PET, CT)입니다. 그들은 수없는, 시간owever 때문에 단일 셀 해상도의 부족으로 종양의 진행을 구동 전이의 초기 단계와 세포 메커니즘을 공개합니다. 그 때까지는 폐 전이가이 양식에서 볼 수 있습니다, 그들은 잘 설립 및 확산된다. 그들은 훨씬 이전에 이미 도달 생존의 초기 단계 촬상 19 예상보다 도착 파종 성 종양의 폐에 도달하거나 17 생존하지 않거나 초기 휴지 18 남아 세포 및 관찰의 90 %가 중요하게되는 예상 주어 원거리 사이트에 시딩 전이성 종양 성장의 반복 과정을 이해.
폐에서 이러한 관측을 수행하면 그러나 매우 어려운 입증했다; 영상화 연구의 대부분은 단지 하나의 시점에서 폐로보기를 제공 체외 이식편 또는 제제 (20-23)을 이용했다. 이러한 준비는 유용한 정보를 제공 할 수 있지만rmation, 그들은 미세 환경의 다양한 구성 요소 사이에 발생하는 상호 작용, 원인과 결과 관계, 역학의 완전한 이해를 제공하지 않습니다. 적절한 순환 시스템 (및 항상성 수반 불균형)과 신체의 면역 시스템의 나머지 부분에서 단절의 부족은 내리기이 제제는 생체 내에서 그대로 조직에서 생성 결론을 확인 할 수 있습니다.
많은 그룹은 Wearn과 독일은 흉막 층 (24)을 노출 외과 적 먼저 테리 이식 이미징 창 (25)을 활용하는 첫번째 인에 그대로 폐 2,4,5,24-33의 생체 내에 이미징을 수행했습니다.
폐의 고해상도 영상은 크게 폐의 지속적인 움직임에 의해 방해되고, 몇몇 기술은 이러한 한계를 극복하기 위해 개발되었다. 바그너와 Filley 27 개 폐의 자연적인 움직임을 연구바그너는 조직 (28)를 고정하기 위해 자신의 창 수술 준비에 진공을 이용하면서 상대적으로 고정 된 영역에 걸쳐 이식 창을 찾기 위해 자신의 수술 프로토콜을 설계했습니다. 기관지 클램프, 순차적 인 가사와 게이트 이미징, 오버 샘플링 수집, 폐 엽 진공 (34)의 접착 : 그 이후, 다양한 기술은 이미지에 포함 폐를 활용하고있다. 이러한 각각의 장단점을 갖고 어떤 하나의 기술은 서로 34 우량 등장하지 않았다. 예를 들어, 기관지 클램핑 순차적 무호흡증은 폐에서 가스의 정상적인 교환을 변경하고 무기폐의 원인이 될 수 있습니다. 정문 이미징 및 오버 샘플링 된 인수는 이러한 단점을하지만 고속 또는 전문 영상 장비 널리 액세스 할 수 없습니다 필요하지 않습니다. 결국 폐 모두 접착제 및 진공 기술은 상술 한 문제점을 모두 피할 수 있지만,주의가 탁하지 않은 경우 전단력에 의한 손상을 나타낼 수있다엉. 최근, 진공 창 소형화되었고 공 초점 및 다 광자 현미경 4,5,33 우수한 고해상도 화상을 사용하여 마우스에서 사용되도록 획득 된이. 표 1은 이러한 오랜 역사를 요약 및 신규를 설명 그 종이를 강조 생체 내에 폐 촬상 창 사용의 발전.
이 프로토콜은 가능한 가장 높은 세포 내 해상도 라이브, 그대로 폐의 이미지 전이에 장시간 경과 광자 생체 내에 현미경의 사용을 설명합니다. 이미지는 고 개구 수 대물 렌즈 복수 광전자 증 배관 (PMT) 검출기를 구비 한 다 광자 현미경을 사용하여 최대 12 시간 동안 획득된다. 형질 전환 마우스 모델은 형광 고 분자량 덱스 트란과 형광 단백질 형질 전환 된 종양 세포 (혈관과 종양 세포가 respectivel 레이블을 함께 형광 라벨 기본 식세포에 사용된다와이). 형광 표지 된 세포의이 선택은 종양 세포 내피 세포 – 대 식세포 상호 작용과 역학의 시각화 할 수 있지만,이 프로토콜은 형광 또는 비 형광 마우스의 변형을 위해 작동합니다. 인수 후, 잔류 드리프트 운동 (있는 경우) 레이블이없는 순환 혈액 세포에 의한 점멸 제거하기 위해 35, 36 및 사용자 지정 매크로 시간 평균에게 혈관 채널을 플러그인 피지를 사용하여 제거된다.
이 프로토콜은 촬상 전이에 초점을 맞추고 있지만, 기술은 폐 고해상도 단일 셀 이미징 관찰 다른 여러 생물학적 과정에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 및 항체로 형광 표지 기능 태그와 함께 생체 광학 영상에서 높은 해상도는 전이성 캐스케이드에 대한 우리의 이해를 증가 극적으로했다. 이는 직접적인 시각화 및 단일 셀 및 종양 세포의 서브 세포 매개 숙주 세포 및 미세 정량화있게되었다. 기본 종양 내에서이 영상은 성장 침입 또는 보급 6,7 중 하나의지지 이산 미세 환경의 발견, 예를 들어, 주도하고있다. 침략의 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
Riferimenti
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
- Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
- Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
- Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
- Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
- Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
- Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
- St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
- Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
- De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
- Wagner, W. W., Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
- Wagner, W. W. Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
- Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
- Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
- Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
- Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Hauser, H., Wagner, R. . Mammalian cell biotechnology in protein production. , (1997).
- Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
- Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).
