De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
Metástases para locais secundários, tais como o pulmão, fígado e ossos é um evento traumático com uma taxa de mortalidade de cerca de 90% 1. Desses sites, o pulmão é o mais difícil de avaliar utilizando imageamento óptico intravital devido à sua posição fechada dentro do corpo, delicada natureza eo papel vital na manutenção da fisiologia adequada. Enquanto modalidades clínicas (tomografia por emissão de positrões (PET), ressonância magnética (MRI) e tomografia computadorizada (CT)) são capazes de fornecer imagens não invasivas deste tecido, falta-lhes a resolução necessária para visualizar os primeiros eventos de semeadura, com um único pixel consistindo em quase mil células. Os modelos atuais de metastático de pulmão semeadura postulado de que eventos apenas após a chegada de uma célula de tumor são determinística para a sobrevivência e crescimento subseqüente. Isto significa que as ferramentas de imagem em tempo real intravital com resolução de célula única 2 são necessários para definir os fenótipos da CEL semeadurals e testar esses modelos. Embora imagens ópticas de alta resolução do pulmão tem sido realizada utilizando várias preparações ex vivo, estas experiências são tipicamente ensaios ponto de tempo único e são susceptíveis a possíveis artefactos e conclusões erradas devido ao ambiente dramaticamente alterada (temperatura, profusão, citoquinas, etc. ) resultante da remoção da cavidade torácica e sistema circulatório 3. Um trabalho recente demonstrou que a imagiologia óptica intravital lapso de tempo do pulmão intacto é possível usar um vácuo estabilizado janela de imagem 2,4,5 No entanto, os tempos típicos de imagiologia têm sido limitada a cerca de 6 horas. Descrevemos aqui um protocolo para a realização de imagens intravital com lapso de tempo a longo prazo do pulmão utilizando uma tal janela ao longo de um período de 12 h. As sequências de imagens de lapso de tempo obtidos utilizando este método permitir a visualização e quantificação de interações célula-célula, a dinâmica da membrana e perfusão vascular no pulmão. Nós ainda mais dEscribe uma técnica de processamento de imagem que dá uma visão sem precedentes clara da microcirculação pulmonar.
Introduction
Imagens de Alta Resolução óptica intravital tem provado ser essencial para a compreensão de diversos processos biológicos, o que permite de uma única célula e os parâmetros de sub-celular a ser medido e quantificado. Em Cancer Research, imagens intravital de células tumorais e do estroma conduziu à descoberta de diversos interacções microambiente 6-11 que estão presentes apenas no animal intacto.
Descobertas sobre microambientes associados com intravasation e disseminação de células tumorais no cancro da mama usando imagens de resolução óptica de uma única célula in vivo levou inclusive a novos marcadores de prognóstico e resposta ao tratamento em pacientes com câncer de mama 12-16. As melhores tecnologias de imagem disponível para visualização no fundo de órgãos vitais internos intactos são as modalidades clínicas (MRI, PET, CT), que oferecem excelentes vistas sobre o órgão inteiro e pode revelar patologias mesmo antes de produzir sintomas clínicos. Eles são incapazes, however, para revelar as primeiras fases de metástase e os mecanismos celulares de condução progressão do tumor devido à sua falta de resolução de uma única célula. No momento em que as metástases pulmonares são visíveis nessas modalidades, eles estão bem estabelecidos e em proliferação. Dada a estimativa de que 90% das células disseminadas tumorais que chegam ao pulmão ou não sobrevivem 17 ou inicialmente permanecer dormente 18, e a observação de que chegam muito mais cedo do que anteriormente esperado 19, imaginando os primeiros passos de chegada e sobrevivência torna-se crucial para compreendendo o processo de sementeira metastática e recorrência do crescimento tumoral em locais distantes.
A execução dessas observações no pulmão tem se mostrado extremamente difícil no entanto; a grande maioria dos estudos de imagem têm utilizado ex vivo ou explantes preparações 20-23, que só dão uma visão para o pulmão em momentos isolados. Enquanto estas preparações não fornecem informações úteisrmação, eles não dão um completo entendimento das interações, causa e efeito relacionamentos e dinâmicas que ocorrem entre os vários componentes do microambiente. A falta de um sistema circulatório adequado (e concomitante desequilíbrio da homeostase) e a desconexão do resto do sistema imunológico do corpo torna desejoso para validar as conclusões que geram estas preparações em tecido intacto in vivo.
Muitos grupos ter realizado imagens intravital do pulmão intacta 2,4,5,24-33 com Wearn alemão e sendo o primeiro a cirurgicamente expor a camada pleural 24 e Terry o primeiro a utilizar uma janela de imagem implantável 25.
imagiologia de alta resolução no pulmão é fortemente entravada pelo movimento constante do pulmão e várias técnicas têm sido desenvolvidas para ultrapassar esta limitação. Wagner e Filley 27 estudou o movimento natural do pulmão caninoe projetou seu protocolo cirúrgico para localizar sua janela implantado sobre uma região relativamente estável enquanto Wagner utilizado vácuo na sua janela preparação cirúrgica para imobilizar o tecido 28. Desde essa altura, uma variedade de técnicas têm sido utilizados para a imagem do pulmão incluindo: aperto brônquio, apneia sequencial e imagiologia fechado, aquisição de sobreamostragem, colagem do lobo pulmonar e de vácuo 34. Cada uma delas tem as suas vantagens e desvantagens e não uma técnica emergiu como sendo superior a outro 34. Por exemplo, de aperto e apneia do brônquio sequencial normal de alterar a troca de gases no pulmão e pode causar atelectasia. imaging Fechado e aquisição amostrado não sofrem com essas desvantagens, mas exigem alta velocidade ou equipamentos de imagem especializado não é amplamente acessível. Finalmente, tanto a colagem do pulmão e a técnica do vácuo evitar tanto dos inconvenientes acima mencionados, mas pode apresentar lesão induzida força de cisalhamento se o cuidado de não é Taken. Nos últimos anos, a janela de vácuo foi miniaturizado e adaptado para utilização em ratinhos, utilizando microscopia confocal e multifotônica 4,5,33 e excelente imagem de alta resolução foi atingido 2. A Tabela 1 resume esta história rica e destaca os documentos que descrevem novos avanços no uso de janelas de imagem de pulmão intravital.
Este protocolo descreve o uso de microscopia intravital multifotônica lapso de tempo prolongado para a metástase imagem no pulmão vivo, intacto com a resolução mais elevada possível subcelular. As imagens são adquiridas por até 12 horas usando um microscópio multiphoton equipada com uma lente objetiva de alta abertura numérica e detectores múltiplos tubo fotomultiplicador (PMT). modelos de camundongos transgênicos são utilizados para etiqueta fluorescente macrófagos nativas junto com fluorescente alta dextrano de peso molecular e células tumorais proteína transfectadas fluorescentes (de rotular as células da vasculatura e tumorais respectively). Embora esta escolha de células marcadas com fluorescência permite a visualização de interações celulares de macrófagos de células do endotélio de tumor e dinâmicas, este protocolo irá funcionar para qualquer estirpe de rato fluorescente ou não fluorescente. Após a aquisição, o movimento deriva residual (se houver) é eliminado usando um plug-in Fiji 35,36 e personalizados macros tempo médio do canal vascular para eliminar intermitente causada por células do sangue circulante não marcados.
Embora este protocolo incide sobre a metástase de imagens, as técnicas são aplicáveis a muitos outros processos biológicos observáveis com imagiologia de uma única célula de alta resolução no pulmão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alta resolução em imagiologia óptica vivo combinada com etiquetas marcadas fluorescentemente funcionais, tais como proteínas e anticorpos aumentou dramaticamente a nossa compreensão da cascata metastática. Ele permitiu a visualização directa e quantificação de uma única célula e os parâmetros de sub-celulares em células tumorais, células hospedeiras e o seu microambiente. Esta imagem no interior do tumor primário tem levado, por exemplo, para a descoberta de microambientes discretas que…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
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