Automatiseret Robotic Udlevering Teknik for Surface Udviklings- og Bioprinting Celler
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Dette håndskrift beskriver indførelsen af celle vejledning funktioner efterfulgt af direkte levering af celler til disse funktioner i en hydrogel bioink anvendelse af et automatiseret robot doseringssystem. Den særlige bioink blev valgt som det tillader celler at sedimentere mod og fornemme funktioner. Dispenseringssystemet bioprints levedygtige celler i hydrogel bioinks bruger modtryk assisteret printhovedet. Men ved at erstatte skrivehovedet med en skærpet pen eller skalpel, dispenseringssystemet kan også anvendes til at skabe topografiske signaler gennem overfladen ætsning. Pennen bevægelse kan programmeres i trin på 10 um i X, Y og Z-retningerne. De mønstrede riller kunne orientere mesenkymstamceller, påvirke dem til at vedtage en aflang morfologi på linie med rillerne 'retning. Det mønster kunne designes ved hjælp plotte software i lige linjer, koncentriske cirkler og sinusformede bølger. I en efterfølgende procedure, fibroblaster og mesenchymstamceller blev suspenderet i en 2% gelatine bioink, for bioprinting i et modtryk drevet ekstrudering printhovedet. Cellen bærende bioink blev derefter trykt med de samme programmerede koordinater anvendes til ætsning. De bioprinted celler var i stand til at sanse og reagere på de ætsede træk, som vist ved deres langstrakte orientering langs retningen af de ætsede riller.
Introduction
Den bevidste mønsterdannelse af celle anbringelse muliggør dannelsen af kulturer, der efterligner in vivo cellulær organisation 1. Faktisk kan forskning i samspillet mellem flere celletyper bistås ved at organisere deres rumlige placering 2,3. De fleste mønsterruller systemer er baseret på overfladen modifikation procedurer for at fremme eller forhindre celleadhæsion med efterfølgende passiv celle deposition. Bioprinting tilbyder rumlig og tidsmæssig kontrol over celle distributioner 1. Ud over disse funktioner, er bioprinting blevet beskrevet som værende en teknisk enkel, hurtig og omkostningseffektiv metode til generering geometrisk komplekse stilladser 4. Det udnytter computer design software og tillader indførelsen af celler i produktionsprocessen 4.
Bioprinting systemer er blevet kategoriseret baseret på deres arbejdsforhold principper som laser baserede, inkjet-baserede eller ekstrudering-baserede 4. Ekstrudering bioprinting er blevet beskrevet som den mest lovende, da det giver mulighed for fremstilling af organiserede konstruktioner af klinisk relevante størrelser inden for en realistisk tidshorisont 4-6. Det udføres af enten mekanisk eller modtryk assisteret ekstrudering af en celle forsynet hydrogel bioink. I fremgangsmåden præsenteres her, blev modtryk anvendes. Som nævnt cellerne leveres i en cytocompatible bioink. En sådan bioink bør støtte leveringen af celler uden at frembringe skadelige shear stress, og være af en tilstrækkelig viskositet til at bevare integriteten af den trykte spor, uden at bryde sammen eller spredning (benævnt "blæk bløder") 7-10.
Interaktionen af celler med deres klæbende overflade er kendt for at påvirke cellulær adfærd. Overfladen topografi kan styre celleform, orientering 11, og selv fænotypen. Især har fremstillingen af riller og kanaler blevet påvist at inducereen strakt, aflang morfologi på flere celletyper. Vedtagelsen af denne morfologi har vist sig at påvirke fænotypen af multipotente og pluripotente celler. For eksempel, når tilnærmes riller, mesenchymstamceller (MSC) viser tegn på differentiering i retning cardiomyocytes 12,13 og vaskulære glatte muskelceller vedtage den kontraktile fænotype over syntetiske 10,14-17.
Cellen tilpasse kanaler eller riller kan genereres på en polymer overflade via en række fremgangsmåder, for eksempel, dyb reaktiv ion ætsning, elektronstrålelitografi, direkte laserprint, femtosekundlaser, fotolitografi og plasma tør ætsning 18. Disse metoder er ofte tidskrævende, kræver kompleks apparat og kan være begrænsende i form på det mønster genereret. Hertil kommer, at de ikke synkronisere mønster med bioprinting og ikke giver mulighed for øjeblikkelig cellularization. Den koordineret kontrolleret bevægelse af en automatiseretdispenseringssystem kan følge komplekse mønstre til udfældning af løsninger. Her demonstrerer vi, hvordan mikroskala-styret bevægelse kan udnyttes til at skabe kanaler for celle orientering. En skærpet pen eller skalpel er fastgjort til printhovedet i stedet for ekstrudering sprøjten og udstyret kan derefter ætse polymeroverfladen under vejledning af den plotte software. Fremgangsmåden giver alsidighed i mønster design og gælder for polymere materialer, der almindeligvis anvendes i bioteknologi, såsom polystyren, PTFE, og polycaprolacton. Som et efterfølgende trin til ætsning kan celler bioprinted direkte til de ridsede riller. Gelatinen bioink anvendt her var i stand til både at opretholde sporet og tillade de aflejrede celler til at føle de ætsede funktioner. Mesenkymale stamceller bioprinted til de ætsede riller blev påvist at forlænge ad dem i forskellige linjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det kritiske trin i denne procedure er den faktiske bioprinting levering af stamcellerne som processen skal give celle sedimentering til de funktioner, udskrives uden bioink breder / blødning, leverer celler uden shear stress celledød og ikke udløser differentiering mod uønsket afstamning.
Hvis den forventede cellejustering ikke forekomme, så bioink viskositet bør vurderes for sin egnethed til udskrivning. Det er vigtigt, at bioink tillader cellerne at sedimentere til den mønstrede po…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Riferimenti
- Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. . Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).
- Lee, K. V., Turksen, K., et al. . Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels – The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
