Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Dit manuscript beschrijft de introductie van cellen Praktische kenmerken gevolgd door de directe afgifte van cellen om deze functies in een hydrogel bioink een geautomatiseerd robot doseersysteem. De specifieke bioink werd gekozen omdat het cellen mogelijk maakt sediment richting en zin de functies. Het doseersysteem bioprints levensvatbare cellen in hydrogel bioinks met behulp van een tegendruk bijgestaan printkop. Echter, door het vervangen van de printkop met een scherpe pen of scalpel, het doseersysteem kan ook worden gebruikt om topografische signalen door bovengrondse etsen maken. De beweging stylus kan worden geprogrammeerd in stappen van 10 urn in de X, Y en Z richting. De gevormde groeven konden mesenchymale stamcellen oriënteren, beïnvloeden ze een langwerpige morfologie uitgelijnd vast met de richting van de groeven. Het patroon kan worden gemaakt met behulp plotsoftware in rechte lijnen, concentrische cirkels, en sinusgolven. In een volgende procedure, fibroontploffing en mesenchymale stamcellen werden gesuspendeerd in een 2% gelatine bioink voor bioprinting een tegendruk gedreven extrusie printkop. De cel dragende bioink werd vervolgens bedrukt met dezelfde geprogrammeerde coördinaten gebruikt voor het etsen. De bioprinted cellen konden detecteren en reageren op de geëtste eigenschappen zoals blijkt uit hun gerekte orientatie langs de richting van de geëtste groeven.
Introduction
Het opzettelijk patroonvorming van cel plaatsing maakt de vorming van culturen die na te bootsen in vivo cellulaire organisatie 1. Inderdaad, kan het onderzoek naar de interactie tussen verschillende celtypen worden bijgestaan door het organiseren van hun ruimtelijke plaatsing 2,3. De meeste systemen patronen afhankelijk oppervlaktemodificatie procedures voor het bevorderen of het voorkomen van celhechting aan latere passieve cel depositie. Bioprinting biedt ruimtelijke en temporele controle over de cel distributies 1. Naast deze functies is bioprinting beschreven als een technisch eenvoudige, snelle en kosteneffectieve werkwijze voor het complexe geometrische scaffolds 4. Het maakt gebruik van computer design software en maakt de introductie van cellen in het fabricageproces 4.
Bioprinting systemen zijn gecategoriseerd op basis van hun werkingsprincipes als laser gebaseerde, inkjet gebaseerde of extrusie-gebaseerde 4. Extrusie bioprinting is beschreven als het meest veelbelovend als het laat de fabricage van de georganiseerde constructies van klinisch relevante maten binnen een realistische termijn 4-6. Zij worden uitgevoerd door zowel mechanisch als tegendruk bijgestaan extrusie van een cel die hydrogel bioink. In de hier gepresenteerde methode werd tegendruk toegepast. Zoals gezegd, worden de cellen geleverd in een cytocompatible bioink. Dergelijke bioink moet het versterken van cellen ondersteunen zonder dat schadelijke afschuifspanning en zijn van voldoende viscositeit om de integriteit van de gedrukte sporen behouden zonder instorten of verspreider (aangeduid als "inkt bleed") 7-10.
De interactie van cellen met het oppervlak dat bedekt is bekend dat cellulaire beïnvloeden. Het oppervlak topografie kan de vorm cel oriëntatie 11, en ook het fenotype regelen. In het bijzonder zijn de fabricage van groeven en kanalen aangetoond dat inducereneen verlengde langwerpige morfologie op meerdere celtypen. De goedkeuring van deze morfologie is gevonden om het fenotype van multipotente en pluripotente cellen te beïnvloeden. Bijvoorbeeld, wanneer uitgelijnd op goten, mesenchymale stamcellen (MSC) er aanwijzingen differentiatie richting cardiomyocyten 12,13 en vasculaire gladde spiercellen nemen het contractiele fenotype via synthetische 10,14-17.
De cel uitlijnen kanalen of groeven kunnen worden geproduceerd op een polymeeroppervlak via een aantal methoden, bijvoorbeeld diep reactief ionen etsen, electron beam lithografie, direct printen, femtosecondlaser, fotolithografie en droog etsen plasma 18. Deze benaderingen zijn vaak tijdrovend, vereist ingewikkelde apparatuur en kunnen beperkend in de vorm van het gegenereerde patroon. Bovendien hebben ze geen patronen met bioprinting synchroniseren en houden geen rekening met onmiddellijke cellularization. De coordinately gecontroleerde beweging van een geautomatiseerdeafgiftesysteem kunnen complexe patronen volgen voor de depositie van oplossingen. Hier laten we zien hoe de microschaal gecontroleerde beweging kan worden benut om kanalen voor mobiele oriëntatie te creëren. Een scherpe pen of scalpel wordt in plaats van extrusie spuit de printkop bevestigd en materiaal kan vervolgens etsen polymeeroppervlak onder leiding van de plotsoftware. De werkwijze biedt veelzijdigheid patroonontwerp, geldt voor polymere materialen gewoonlijk in bioengineering zoals polystyreen, PTFE en polycaprolacton. Als een volgende stap het etsen, kunnen de cellen direct worden bioprinted de groeven bekrast. De gelatine bioink hier gebruikt was in staat om zowel handhaven van de sporen en laat de afgezette cellen om de geëtste kenmerken voelen. Mesenchymale stamcellen bioprinted op de geëtste groeven werden aangetoond langwerpige daarlangs in duidelijke lijnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritische stap van deze procedure is de feitelijke bioprinting levering van de stamcellen de procescel sedimentatie moet toelaten de functies afdrukken zonder bioink verspreiden / bloeden, cellen leveren zonder schuifspanning celdood en niet tot differentiatie ongewenste richting lijn.
Indien de verwachte celuitlijning uitblijft, wordt de bioink viscositeit moeten worden beoordeeld op zijn geschiktheid voor afdrukken. Het is belangrijk dat de bioink kunnen de cellen sedimenteren de patroo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Riferimenti
- Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. . Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).
- Lee, K. V., Turksen, K., et al. . Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels – The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
