Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Questo manoscritto descrive l'introduzione di elementi di orientamento cellule seguita dalla consegna diretta delle cellule di queste caratteristiche in un bioink idrogel utilizzando un sistema di erogazione automatico robotizzato. La particolare bioink stata selezionata in quanto consente alle cellule di sedimentare verso e rilevano le caratteristiche. Il sistema di erogazione bioprints cellule vitali in bioinks idrogel usando una contropressione assistito testina di stampa. Tuttavia, sostituendo la testina di stampa con uno stilo o bisturi affilata, il sistema di erogazione può anche essere impiegato per creare segnali topografici attraverso incisione superficiale. Il movimento dello stilo può essere programmata in passi di 10 micron in X, Y e Z. Le scanalature modellate erano in grado di orientare le cellule staminali mesenchimali, influenzando ad adottare una morfologia allungata in allineamento con la direzione dei solchi. Il patterning potrebbe essere progettato utilizzando il software tracciare linee rette, cerchi concentrici, e onde sinusoidali. In una procedura successiva, fibroesplosioni e le cellule staminali mesenchimali sono stati sospesi in una gelatina bioink 2%, per bioprinting in una contropressione guidato di estrusione della testina di stampa. Il bioink cuscinetto cella è stata poi stampata utilizzando le stesse coordinate programmate utilizzate per l'incisione. Le cellule bioprinted erano in grado di rilevare e reagire alle caratteristiche incise come dimostrato dal loro orientamento allungata lungo la direzione delle scanalature incise.
Introduction
Il patterning deliberata di posizionamento cellulare consente la formazione di culture che imitano in vivo organizzazione cellulare 1. In effetti, la ricerca l'interazione tra più tipi di cellule può essere assistito da organizzare la loro collocazione spaziale 2,3. La maggior parte dei sistemi di patterning si basano su procedure di modifica della superficie per favorire o impedire l'adesione delle cellule con successiva deposizione delle cellule passiva. Bioprinting offre un controllo spaziale e temporale su distribuzioni cella 1. Oltre a queste funzioni, bioprinting è stato descritto come un metodo tecnicamente semplice, rapida ed economica per generare scaffold geometricamente complesse 4. Utilizza software di progettazione e consente l'introduzione di cellule nel processo di fabbricazione 4.
Sistemi Bioprinting sono stati classificati in base alle loro principi di funzionamento il laser a base, a getto d'inchiostro a base o di estrusione a base di 4. Estrusione bioprinting è stato descritto come il più promettente in quanto permette la realizzazione di costrutti organizzati di dimensioni clinicamente rilevanti entro un lasso di tempo realistico 4-6. E 'eseguita da una pressione meccanica o posteriore di estrusione assistito di un idrogel bioink cuscinetto cellule. Nel metodo qui presentato, è stato impiegato contropressione. Come accennato, le cellule vengono consegnati in un bioink cytocompatible. Tale bioink dovrebbe sostenere la fornitura di cellule senza produrre deleteria sollecitazione di taglio, e di essere di una viscosità sufficiente a mantenere l'integrità della traccia stampata, senza collassare o diffusione (denominato "spurgo inchiostro") 7-10.
L'interazione delle cellule con la loro superficie di adesione è noto per influenzare il comportamento cellulare. La topografia della superficie può controllare la forma delle cellule, l'orientamento 11, e anche il fenotipo. In particolare, la realizzazione di scanalature e canali sono stati dimostrati per indurreun allungato, morfologia allungata su diversi tipi di cellule. L'adozione di questa morfologia è stato trovato per influenzare il fenotipo di cellule multipotenti e pluripotenti. Ad esempio, quando allineato scanalature, cellule staminali mesenchimali (MSC) mostrano segni di differenziamento verso cardiomiociti 12,13 e cellule muscolari lisce vascolari adottare il fenotipo contrattile sul sintetico 10,14-17.
La cella allineando canali o scanalature può essere generato su una superficie polimerica tramite un certo numero di metodi, per esempio, profonda attacco con ioni reattivi, litografia a fascio elettronico, stampa laser diretta, laser a femtosecondi, fotolitografia e attacco a secco plasma 18. Questi approcci sono spesso lunghi, richiedono apparecchiatura complessa e può essere limitante nella forma del modello generato. Inoltre, essi non si sincronizzano con patterning bioprinting e non consentono cellularization immediato. Il movimento coordinato controllato di un sistema automatizzatosistema di erogazione può seguire schemi complessi per la deposizione di soluzioni. Qui mostriamo come il movimento microscala controllata può essere sfruttata per creare canali per l'orientamento delle cellule. Uno stilo o bisturi affilato è collegata alla testina di stampa al posto della siringa estrusione e le attrezzature possono incidere la superficie del polimero sotto la guida del software di tracciatura. Il metodo offre versatilità nella progettazione del modello ed è applicabile ai materiali polimerici comunemente utilizzati in bioingegneria come polistirolo, PTFE, e policaprolattone. Come fase successiva alla incisione, le cellule possono essere bioprinted direttamente alle scanalature graffiati. Il bioink gelatina utilizzato qui è stato in grado sia di mantenere la traccia e consentire alle cellule depositate per rilevare la funzionalità incise. Le cellule staminali mesenchimali bioprinted alle scanalature incise sono state dimostrate per allungare lungo loro in linee distinte.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fase critica di questa procedura è la consegna bioprinting reale delle cellule staminali come il processo deve consentire di sedimentazione delle cellule alle caratteristiche, di stampa senza la diffusione bioink / sanguinamento, fornire cellule senza morte cellulare sforzo di taglio e non innescare la differenziazione verso lignaggio indesiderati.
Se l'allineamento delle cellule previsto non si verifica, quindi la viscosità bioink dovrebbe essere valutato per la sua idoneità per l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Riferimenti
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