細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
この原稿は、自動ロボット分配システムを使用して、ヒドロゲルbioinkこれらの機能への細胞の直接送達に続いて、細胞ガイダンス機能の導入について説明します。それは、細胞が向かって沈降や機能を感知することを可能にするように、特定のbioinkを選択しました。分配システムは、背圧アシスト記録ヘッドを用いたヒドロゲルbioinks中の生存細胞をbioprints。しかし、尖ったスタイラスまたはメスでプリントヘッドを交換することによって、分配システムは、表面エッチングによって地形キューを作成するために使用することができます。スタイラスの動きは、X、Y及びZ方向に10ミクロンのステップでプログラムすることができます。パターン化された溝は、溝 '方向に整合した細長い形態を採用するように影響を与える、間葉系幹細胞を配向することができました。パターニングは、直線、同心円、及び正弦波にプロットソフトウェアを用いて設計することができます。以降の手順では、線維芽細胞および間葉系幹細胞は、背圧駆動押し出しプリントヘッドにbioprintingために、2％ゼラチンbioinkに懸濁しました。細胞軸受bioinkは、その後エッチングに使用したのと同じプログラムの座標を用いて印刷しました。 bioprinted細胞が感知し、エッチングされた溝の方向に沿った細長い配向によって実証されるようにエッチングされた機能に対応することができました。
Introduction
セル配置の意図的なパターニングは、 インビボ細胞、組織1 で模倣文化の形成を可能にします。実際、複数の細胞型の間の相互作用の研究は、それらの空間配置2,3を編成することによって支援することができます。ほとんどのパターン形成システムは、後続の受動細胞沈着を伴う細胞接着を促進または防止するための表面修飾方法に依存しています。 Bioprintingは、細胞分布1以上の空間的および時間的な制御を提供しています。これらの機能に加えて、bioprintingは、幾何学的に複雑な足場4を生成するための技術的に、簡単迅速かつ費用効果的な方法であると記載されています。これは、コンピュータ設計ソフトウェアを利用し、製造プロセス4への細胞の導入を可能にします。
Bioprintingシステムは、レーザーベースのインクジェットベースまたは押出しベース4としての動作原理に基づいて分類されています。それは現実的な時間枠内4-6臨床的に関連するサイズの組織化構築物の製造を可能にするように、押出bioprintingは最も有望なものとして説明されています。これは、細胞担持ヒドロゲルbioinkの機械的または背圧補助押出のいずれかによって行われます。ここに提示された方法では、背圧を使用しました。前述したように、細胞は、細胞適合性bioinkで配信されます。このようなbioinkは、有害なせん断応力を生じることなく細胞の送達をサポートし、崩壊または7-10（「インクブリード」と呼ばれる）拡散することなく、印刷されたトレースの完全性を保持するのに十分な粘度であるべきです。
それらの接着面との細胞の相互作用は、細胞の挙動に影響を与えることが知られています。表面トポグラフィは、細胞の形状、方向11、さらに表現型を制御することができます。具体的には、溝およびチャネルの製造を誘導することが実証されています複数の細胞型に伸ばし、細長い形態。この形態を採用する多能及び多能性細胞の表現型に影響を与えることが見出されています。例えば、溝に整列させた場合、間葉系幹細胞（MSC）の合成10,14-17上に収縮性表現型を採用心筋12,13および血管平滑筋細胞への分化の証拠を示します。
チャネル又は溝を整列させる細胞は、例えば、ディープ反応性イオンエッチング、電子ビームリソグラフィ、直接レーザー印刷、フェムト秒レーザー、フォトリソグラフィおよびプラズマドライエッチング18、多数の方法を介してポリマー表面上に生成することができます。これらのアプローチは、多くの場合、時間がかかり、複雑な装置を必要とし、生成されたパターンの形状に限定することができます。また、彼らはbioprintingパターニングを同期しないと即時細胞化することができません。自動化の協調制御された動き分配システムは、ソリューションの堆積のための複雑なパターンに従うことができます。ここでは、マイクロ制御運動が細胞配向のためのチャネルを作成するために利用することができる方法を示しています。尖ったスタイラスまたはメス押出注射器の代わりに、プリントヘッドに取り付けられ、装置は、その後、描画ソフトウェアの指導の下でポリマー表面をエッチングすることができます。この方法は、パターン設計で汎用性を提供し、一般に、ポリスチレン、PTFE、ポリカプロラクトンなどの生物工学に使用されるポリマー材料にも適用可能です。エッチングに続いてのステップとして、細胞が傷の溝に直接bioprintedすることができます。ここで利用されるゼラチンbioinkは、トレースを維持し、堆積した細胞は、エッチングされた特徴を検出することを可能にするのに両方のことができました。エッチングされた溝にbioprinted間葉系幹細胞は、異なる行にそれらに沿って伸長することが実証されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この手順の重要なステップは、プロセスが、機能に細胞沈降を可能に出血/ bioinkが広がることなく印刷し、せん断応力の細胞死せずに細胞を送達し、不要な系統への分化を誘発してはならないように、幹細胞の実際のbioprinting配信です。
期待されるセルの配置が発生し失敗した場合は、bioink粘度は、印刷のためのその適合性について評価すべきです。 bioink細胞がパターン…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
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