Automatiserad Robotic Doserings Teknik för Surface utvecklings- och Bioprinting av celler
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Detta manuskript beskriver införandet av cellvägledningsfunktioner, följt av direkt leverans av celler till dessa funktioner i en hydrogel bioink användning av en automatiserad robotdoseringssystem. Den speciella bioink valdes eftersom det tillåter celler att sedimentera mot och avkänna de funktioner. Doseringssystemet bioprints viabla celler i hydrogel bioinks med användning av en mottrycks assisterad skrivarhuvudet. Emellertid genom att ersätta skrivhuvud med en vass penna eller skalpell, dispenseringssystemet kan också användas för att skapa topografiska cues genom ytetsning. Pennan rörelsen kan programmeras i steg om 10 | j, m i X-, Y- och Z-riktningarna. De mönstrade spår kunde orientera mesenkymala stamceller, som påverkar dem att anta en långsträckt morfologi i linje med spåren 'riktning. Mönstringen kan utformas med hjälp av plottning programvara i raka linjer, koncentriska cirklar, och sinusvågor. I ett efterföljande förfarande, fibroblaster och mesenkymala stamceller suspenderades i en 2% gelatin bioink, för bioprinting i ett mottryck driven strängsprutningsskrivhuvudet. Celllager bioink därefter ut genom att använda samma programmerade koordinaterna som används för etsning. De bioprinted celler kunde känna av och reagera på de etsade funktioner vilket framgår av deras långsträckt orientering längs riktningen av de etsade spåren.
Introduction
Avsiktlig mönstring av cell placering möjliggör bildandet av kulturer som efterliknar in vivo cellulära organisation 1. I själva verket kan forskning om samspelet mellan flera celltyper bistås genom att organisera deras rumsliga placering 2,3. De flesta mönstring system förlitar sig på ytan modifieringsförfaranden för att främja eller förhindra celladhesion med efterföljande passiv cell nedfall. Bioprinting erbjuder rumsliga och tidsmässiga kontroll över cellfördelningar 1. Utöver dessa funktioner har bioprinting beskrivits som ett tekniskt okomplicerad, snabb och kostnadseffektiv metod för att generera geometriskt komplicerade ställningar 4. Den använder dator design mjukvara och tillåter införandet av celler in i tillverkningsprocessen 4.
Bioprinting system har kategoriseras baserat på verksamhetsprinciper som laserbaserade, bläckstrålebaserad eller extrudering baserade 4. Extrudering bioprinting har beskrivits som den mest lovande eftersom den tillåter tillverkning av organiserade konstruktioner av kliniskt relevanta storlekar inom en realistisk tidsram 4-6. Den utförs genom antingen mekanisk eller baktryck assisterad strängsprutning av en cellbärande hydrogel bioink. I metoden som presenteras här, tillbakaextraherades tryck som användes. Såsom nämnts, är cellerna levereras i en cytocompatible bioink. Sådan bioink bör stödja leveransen av celler utan att producera skadliga skjuvspänning, och vara av en tillräcklig viskositet för att bibehålla integriteten hos den tryckta spår, utan att kollapsa eller sprida (kallad "färgblödning") 7-10.
Interaktionen av celler med sin vidhäftande yta är känd för att påverka cellbeteende. Yttopografin kan styra cellform, orientering 11, och till och med den fenotypen. I synnerhet, har tillverkningen av spår och kanaler visats induceraen sträckt, långsträckt morfologi på flera celltyper. Antagandet av denna morfologi har visat sig påverka fenotypen av multipotenta och pluripotenta celler. Till exempel, då de är inriktade på spår, mesenkymala stamceller (MSC) uppvisar tecken på differentiering mot kardiomyocyter 12,13 och vaskulära glatta muskelceller anta den kontraktila fenotypen över den syntetiska 10,14-17.
Cellen anpassa kanaler eller spår kan genereras på en polymer yta via ett antal metoder, till exempel djup reaktiv jonetsning, elektronstrålelitografi, direkt laserutskrift, femtosecond laser, fotolitografi och plasmatorretsning 18. Dessa tillvägagångssätt är ofta tidskrävande, kräver komplex apparatur och kan vara begränsande i form av mönstret genereras. Dessutom behöver de inte synkronisera mönstring med bioprinting och inte tillåter omedelbar cellularization. Den koordinerat kontrollerad rörelse av en automatiseraddispenseringssystem kan följa komplexa mönster för avsättningen av lösningar. Här kan vi visa hur mikroskala-kontrollerad rörelse kan utnyttjas för att skapa kanaler för cell orientering. En skärpt penna eller skalpell är fäst vid skrivhuvudet i stället för den strängsprutnings sprutan och utrustningen kan sedan etsa polymerytan under ledning av den plottning programvara. Metoden ger mångsidighet i mönsterkonstruktion och är tillämplig på polymera material som vanligtvis används i bioteknik, såsom polystyren, PTFE, och polykaprolakton. Som ett efterföljande steg på etsnings kan celler bioprinted direkt till de repade spåren. Gelatinet bioink utnyttjas här kunde både underhålla spår och låta de deponerade cellerna att känna de etsade funktioner. Mesenkymala stamceller bioprinted till de etsade spåren visades långsträckt utmed dem i skilda linjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det kritiska steget i detta förfarande är den faktiska bioprinting leverans av stamceller som processen måste tillåta cellsedimentering till funktioner, skriva ut utan bioink spridning / blödning, levererar celler utan skjuvspänning celldöd och inte utlöser differentiering mot oönskad härstamning.
Om den förväntade celljustering inte inträffa, då bioink viskositeten bör utvärderas för dess lämplighet för utskrift. Det är viktigt att den bioink tillåter cellerna att sedim…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Riferimenti
- Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. . Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).
- Lee, K. V., Turksen, K., et al. . Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels – The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
