Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Bu el yazması bir otomatik robot dağıtım sistemini kullanarak bir hidrojel bioink bu özelliklere hücrelerin doğrudan teslim takiben hücre rehberlik özelliklerinin tanıtım açıklar. hücrelerin doğru tortu ve özellikleri anlamda verir gibi belirli bioink seçildi. dağıtma sistemi bir geri basınç destekli yazıcı kafasını kullanarak hidrojel bioinks içinde canlı hücreleri bioprints. Ancak, bilenmiş kalemle veya neşter ile yazıcı kafasını değiştirerek, dağıtım sistemi de yüzey aşındırma yoluyla topografik ipuçları oluşturmak için kullanılabilir. stylus hareketi X, Y 10 mikron adımları ve Z yönlerinde programlanabilir. desenli oluk oluklar 'yönü ile uyum içinde uzunlamasına bir morfolojisi benimsemeye bunları etkileyen, mezenkimal kök hücreleri yönlendirmek başardık. desenlendirme düz çizgiler, iç içe daireler ve sinüzoidal dalgalar halinde komplo yazılımı kullanılarak dizayn edilebilir. Bir sonraki işlem, fibro içindepatlamalar ve mezenkimal kök hücreleri, bir karşı basınç tahrik ekstrüzyon yazıcı kafasının bioprinting için,% 2 jelatin bioink içinde süspansiyon haline getirildi. Hücre taşıyan bioink sonra gravürü için kullanılan aynı programlanmış koordinatları kullanılarak basılmıştır. bioprinted hücreler duyu ve kazınmış oluklar doğrultusu boyunca onların uzatılmış yönelim gösterdiği gibi kazınmış özelliklere tepki başardık.
Introduction
Hücre yerleştirme kasıtlı desenlendirme in vivo hücresel organizasyonun 1 taklit kültürlerin oluşumunu sağlar. Nitekim, birden fazla hücre tipleri arasındaki etkileşim içine araştırmalar mekansal yerleştirme 2,3 düzenleyerek yardım edilebilir. Çoğu desenlendirme sistemleri teşvik veya sonraki pasif hücre birikimi ile hücre yapışmasını önlemek için yüzey modifikasyon prosedürleri güveniyor. Bioprinting hücre dağılımları üzerinde 1 mekansal ve zamansal kontrol sunuyor. Bu fonksiyonlara ek olarak, bioprinting geometrik olarak kompleks yapı iskelesi 4 üretilmesi için bir teknik, basit bir hızlı ve düşük maliyetli bir yöntem olarak tarif edilmiştir. Bu bilgisayar tasarım yazılımı kullanan ve üretim süreci 4 içine hücrelerin girişine izin verir.
Bioprinting sistemleri lazer tabanlı olarak çalışma prensiplerine göre sınıflandırılır edilmiştir, mürekkep püskürtmeli tabanlı veya 4 ekstrüzyon tabanlı. Gerçekçi bir süre 4-6 içinde klinik olarak önemli boyutta organize yapıların imalatı izin verdiği Ekstrüzyon bioprinting en umut verici olarak tarif edilmiştir. Bir hücrenin dayanma hidrojel bioink mekanik ya da geri basınç destekli ekstrüzyon biri tarafından gerçekleştirilir. Burada yer alan yöntemde, geri dönüş basıncı kullanılmıştır. belirtildiği gibi, hücreler, bir cytocompatible bioink teslim edilir. Böyle bir bioink zararlı kayma gerilimi üretmeden hücrelerin teslim destek ve çöken ya da 7-10 ( "baskı kanaması" olarak anılacaktır) yayılma olmadan basılı izidir bütünlüğünü korumak için yeterli bir viskozite olması gerekmektedir.
kendi yapışan yüzeyi ile hücrelerin etkileşim hücre davranışını etkilemek için bilinmektedir. Yüzey topoğrafyası hücre şekli, yönü 11, ve hatta fenotip kontrol edebilirsiniz. Özel olarak, oluklar ve kanallar imalat indüklediği gösterilmiştirçok sayıda hücre türleri üzerinde gerilmiş, ince uzun morfolojisi. Bu morfoloji kabul multipotent ve pluripotent hücreler fenotipini belirler bulunmuştur. Örneğin, oluklar hizaya zaman, mezenkimal kök hücreler (MSC) sentetik 10,14-17 üzerinde kasılma fenotip kabul kardiyomiyositlerinin 12,13 ve damar düz kas hücrelerine karşı farklılaşma kanıt gösterebilir.
Kanallar veya oluklar hizalayarak hücre, örneğin, derin reaktif iyon dağlama, elektron demeti, doğrudan lazer baskı, femtosaniye laser, fotolitografi ve plazma kuru aşındırma 18 için, bir dizi yöntem vasıtasıyla bir polimerik yüzey üzerinde oluşturulabilir. Bu yaklaşımlar, çoğu zaman alıcıdır karmaşık bir düzeneği gerekli ve oluşturulan desen şeklinde sınırlayıcı olabilir. Buna ek olarak, bioprinting olan model vermenin senkronize olmayan ve anında Hücreselleştirmeden izin vermemektedir. otomatik bir bir koordineli kontrollü hareketdağıtım sistem çözümleri birikimi için karmaşık desenleri takip edebilirsiniz. Burada mikro kontrollü hareket hücre yönlendirme için kanalları oluşturmak için kullanılabilir gösterilmektedir. Bir sivriltilmiş kalem veya neşter ekstrüzyon şırınga yerine baskı kafası takılır ve ekipmanları daha sonra çizim yazılımı gözetiminde polimer yüzeyi aşındırma edebilirsiniz. yöntemi, desen tasarım esnekliği sağlar ve genel olarak, polistiren, PTFE ve polikaprolakton gibi Biomühendislik kullanılan polimerik materyallere uygulanabilir. Çatlatma, bir sonraki aşamada olduğu gibi, hücreler, çizik oluklar, doğrudan bioprinted edilebilir. Burada kullanılan jelatin bioink iz korumak ve biriken hücreler kazınmış özellikleri hissetmeye izin hem başardı. kazınmış oluklarına bioprinted mezenkimal kök hücrelerin farklı hatlarda kendilerine boyunca uzamaya gösterildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu prosedürün kritik bir adım süreci, özellikleri, hücre sedimantasyon izin kanama / bioink yayma olmadan yazdırmak, kayma gerilmesi hücre ölümü olmadan hücreleri teslim ve istenmeyen soy doğru farklılaşma tetiklemek olmamalıdır olarak kök hücrelerin gerçek bioprinting doğumdur.
beklenen hücre hizalama meydana başarısız olursa, o zaman bioink viskozite baskı için uygunluğu açısından değerlendirilmelidir. Bioink hücreleri desenli polimer yüzeyine tortu sağla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Riferimenti
- Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. . Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).
- Lee, K. V., Turksen, K., et al. . Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels – The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
