Metoder til at studere<em> B. subtilis</em> Biofilm som en model til karakterisering Small Molecule Biofilm Inhibitors

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

Multi-cellulære bakterielle samfund spiller en væsentlig rolle i naturlige og menneskeskabte miljøer, og kan være en fordel eller meget skadelig. Disse flercellede kolonier er kendt som biofilm, hvor de enkelte celler er indlejret i en egenproducerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) matrix. EPS kraftigt klæbe cellerne til overfladen, de koloniserer. De tjener som et skjold mod mekaniske og kemiske kræfter og skabe tæt kontakt mellem de omkringliggende celler, lette cellulær kommunikation ^1. En biofilm kan ses som et differentieret samfund, hvor cellerne bruger stærkt reguleret, orkestreret processer for at koordinere deres aktiviteter i samfundet, samt på tværs af arter ^2-5. Overgangen fra et planktoniske, fritlevende tilstand af vækst til en biofilm tilstand er ofte forbundet med udviklingsprocesser. Et godt eksempel er den grampositive jordbakterie Bacillus subtilis, og derfor et undomesticated belastning tjener som en robust model organisme for at studere de udviklingsmæssige stadier indtil biofilmdannelse. I denne bakterie, bevægelige celler organiserer sig i iøjnefaldende flercellede strukturer, der udfører specialiserede opgaver ^4. En gruppe af celler, de matrix-producenter udskiller exopolysaccharider ^6, det amyloid protein Tasa ^7,8, og overfladen hydrofobicitet protein BslA ^9,10; som alle deltager i samling af EPS ^11-13.

I betragtning af den overflod af biofilm i naturlige og menneskeskabte nicher og den formodede fatale skader, de kan forårsage, er der et presserende behov for at finde måder at forebygge deres dannelse. Små molekyleinhibitorer kan støtte i opdagelsen af ​​nye regulatoriske veje, enzymer og strukturelle proteiner involveret i biofilm dannelse, og dermed fremme indsigt i de komplekse processer flercellede samfund forsamling. Som B. subtilis er en velundersøgte model for biofilmdannelse ^14,15, kan det bruges til at vurdere effekten af forskellige biofilm hæmmere. Denne undersøgelse tackler fire grundlæggende metoder, der er nøglen til evaluering af respons biofilm på inhibitorer med små molekyler. For det første at sikre, at disse inhibitorer har en biofilm-specifikt mål, adskillelse af effekten på planktoniske vækst fra effekten på biofilmdannelse er kritisk. De fleste antibakterielle midler målceller i deres planktoniske vækstfase, men molekyler, der er målrettet biofilmen livsstil er sjældne. Derudover, som molekyler, som ikke påvirker planktoniske vækst er ikke giftige, kan de reducere det selektive pres begunstige antibiotiske resistente mutanter ^16. For eksempel, når biofilm behandles med D-aminosyrer eller visse andre cellevæg-interfererende molekyler, de er enten forstyrres eller skilles ad, men disse inhibitorer kun mildt påvirke planktoniske vækst ^12,17. I modsætning hertil mange antibiotika drastisk forringe planktoniske vækst, med little eller ingen virkning på biofilmdannelse ^17.

For det andet er afgørende indførelse af en homogen og robust eksperimentel rammer at undersøge virkningen af ​​de små molekyler. Vi observerede, at den aktive koncentrationsområde småmolekylære inhibitorer var følsom over for de før-dyrkningsbetingelser og forsøgsopstillingen anvendes til at undersøge virkningen af ​​disse inhibitorer med små molekyler. Forskellige rapporter, især studerer B. subtilis, afslørede variationer i koncentrationsområdet, hvor D-aminosyrer inhiberer dannelsen af pellikeler – de flydende bakterielle biofilm ^12,17-19. Resultaterne præsenteres her tyder på, at følgende faktorer tegner sig for forskelle i den aktive koncentrationsområde: pre-dyrkningsbetingelser (logaritmisk ^12,17 versus sen-stationær fase ²⁰ vækst), vækstmediet anvendt i præ-kultur tilstand (rig, undefined [Luria Broth, LB] versus defineret [mononatriumglutamatglycerol, MSgg]), inokulationen forholdet og især fjernelse af præ-dyrkningsmediet inden inokulering. Temperaturen af ​​statisk hinde vækst viste en mindre vigtig rolle i aktivitetsområdet af den lille molekyle inhibitor D-leucin, en repræsentativ D-aminosyre anvendes i denne undersøgelse.

Endelig, når de biofilm behandles med specifikke biofilm inhibitorer, der kræves robuste og informative metoder til at karakterisere effekten af ​​disse inhibitorer på biofilm fitness. Her er to metoder til selvstændigt karakteriserer virkningen af ​​småmolekylære inhibitorer beskrevet detaljeret: (1) Virkningen på enkeltceller i en biofilm koloni og deres resistens over for antimikrobielle midler. Celler i biofilm er typisk mere resistente over for antibiotika sammenlignet med fritlevende bakterier ^21-23. Mens dette fænomen er multifaktoriel, blev evnen af EPS til at reducere antibiotikum penetration ofte betragtes som en tiltalende forklaring ²⁴ </sup>. Denne metode vurderer overlevelsen af ​​forud fastsatte biofilm celler efter udsættelse for antibakterielle stoffer. (2) Effekten på biofilmen koloni arkitektur, fra den store til den lille skala. Biofilm kolonier karakteriseret ved deres tredimensionale struktur og tilstedeværelsen af ​​EPS. Ved hjælp af scanningselektronmikroskopi, kan ændringer i cellemorfologien, biofilm koloni struktur og arkitekturen og overflod af EPS visualiseres fra den store (mm) til lille skala (um).

Protocol

1. Vurdering af Virkning af småmolekyleinhibitorer på hinde og biofilm Colony Formation Der fremstilles en 2x opløsning af definerede biofilm-inducerende MSgg medium 25 uden calciumchlorid og jern (III) chlorid-hexahydrat. Efter filtersterilisering, tilsæt calciumchlorid. Mediet er klar til brug direkte eller det kan opbevares ved 4 ° C i mørke. Forbered 1x MSgg fortynding på dagen for eksperimentet. Fortynd 2x MSgg medium til 1x med sterilt destilleret vand (pellikeler) e…

Representative Results

Hinden analysen er en metode til at undersøge de stærkt regulerede og dynamiske processer af B. subtilis multicellularity. Ud over dette, er hinden assayet egnet til at teste en række af enten præ-starter betingelser eller små molekyler koncentrationer i en enkelt celle-kultur multiplade plade i ét eksperiment. Imidlertid B. subtilis hinde dannelse er følsom over for de før-dyrkningsbetingelser (f.eks vækstmedium af præ-kulturen og dens vækstfase), podningen forholdet og fjernelsen …

Discussion

Bacillus subtilis formularer robuste og meget strukturerede biofilm både i flydende (pellikeler) og på fast medium (kolonier). Derfor tjener det som en ideel model organisme at karakterisere virkningsmåden af ​​specifikke biofilm inhibitorer. På faste medier, celler danner flercellede strukturer med særlige kendetegn, som ikke er tydelig i pellikeler, ligesom rynker udstråler fra midten til kanten. Således pellikeler og kolonier er supplerende systemer til at studere B. subtilis multicellula…

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA