La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Summary

Molte (fosfo)lipasi previste sono scarsamente caratterizzate per quanto riguarda le loro specificità di substrato e le funzioni fisiologiche. Qui forniamo un protocollo per ottimizzare le attività enzimatiche, cercare substrati naturali e proporre funzioni fisiologiche per questi enzimi.

Abstract

I microrganismi producono un ampio spettro di lipasi (fosfo) che vengono secreti per rendere substrati esterni disponibili per l'organismo. In alternativa, altri (fosfo) lipasi possono essere fisicamente associate con l'organismo producendo causando un turnover di lipidi intrinseche e spesso dando origine ad un rimodellamento delle membrane cellulari. Sebbene potenziali (fosfo) lipasi possono essere previsti con un certo numero di algoritmi quando la sequenza del gene / proteina è disponibile, prova sperimentale delle attività enzimatiche, specificità di substrato e potenziali funzioni fisiologiche è spesso non è stata ottenuta. Questo manoscritto descrive l'ottimizzazione delle condizioni di analisi per i potenziali (fosfo) lipasi con specificità di substrato sconosciute e come impiegare queste condizioni ottimali nella ricerca per il substrato naturale di un rispettivo (fosfo) lipasi. Usando substrati cromogeni artificiali, come i derivati p -nitrophenyl, può aiutare a rilevare un minoreattività enzimatica per un (fosfo) lipasi previsto in condizioni standard. Avendo riscontrato un attività enzimatica tale minore, i parametri distinti di un saggio enzimatico possono essere variate per ottenere un'idrolisi più efficiente del substrato artificiale. Dopo aver determinato le condizioni in cui un enzima funziona bene, una varietà di potenziali substrati naturali devono essere analizzati per la loro degradazione, un processo che può essere seguita con metodi cromatografici distinti. La definizione di specificità di substrato per nuovi enzimi, fornisce spesso ipotesi per un potenziale ruolo fisiologico di questi enzimi, che poi possono essere testati sperimentalmente. Seguendo queste linee guida, siamo stati in grado di identificare una fosfolipasi C (SMc00171) che degrada fosfatidilcolina di phosphocholine e diacylglycerol, in una fase cruciale per il rimodellamento delle membrane nel batterio Sinorhizobium meliloti dalle condizioni di fosforo-limitante della crescita. Per due predetto patatin-come fosfolipasi (SMc00930 e SMc01003) dello stesso organismo, potremmo ridefinire le loro specificità di substrato e chiarire che SMc01003 è una lipasi diacilglicerolo.

Introduction

Lipidi glicerolo-based come trigliceridi e fosfolipidi (glycero) costituiscono importanti e probabilmente il più noti classi di lipidi ^1. Trigliceridi (tag) sono grassi o oli, che di solito fungono da lipidi di stoccaggio, e quindi come potenziali fonti di energia e di carbonio. TAG possono essere degradati dalla lipasi, che sono spesso secrete dall'organismo produzione di digerire variabili esterne e renderli disponibili come fonti di carbonio. Inoltre, lipasi sono stati ampiamente studiati negli anni, grazie alle loro importanti applicazioni biotecnologiche ^2.

A causa della loro natura anfifilica e la loro form....

Protocol

1. Clone e iperespressione del gene strutturale per lipasi prevista

1. Utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) ¹⁴ e oligonucleotidi specifici (Tabella 1) ^15, amplificare il gene di interesse (smc01003, smc00930 o smc00171), previsto per codificare per una lipasi o fosfolipasi, dal DNA genomico dell'organismo ospite (ie , S. meliloti).
   1. Introdurre siti specifici di restrizione (con la sequenza creazione degli oligonucleotidi). Digerire il frammento di DNA amplificato con gli enzimi di restrizione corrispondenti e clonare in un vettore di espressione, com....

Results

Attività di specifici PC fosfolipasi C SMc00171 con Bis- p -nitrophenyl fosfato

Estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) pLysS x, che avevano smc00171 espressi, sono stati studiati per la loro capacità di idrolizzare bis- p esteri -nitrophenyl fosfato, utilizzando un saggio enzimatico spettrofotometrica, misurando la -NP .......

Discussion

Nel corso degli ultimi 20 anni, genomi di molti organismi sono stati sequenziati e anche se una ricchezza di dati sequenza del genoma è stato generato, interpretazione funzionale è in ritardo e ostacola quindi la nostra comprensione della funzione del genoma. funzioni geniche in genomi sono spesso assegnati in base alla somiglianza con geni di funzione nota o di insorgenza di motivi conservati. Tuttavia, la precisa funzione di un dato gene spesso non è noto. Soprattutto, previsto geni strutturali per enzimi non possono .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloroformio	JT Baker	9180-03	Analisi TLC & Estrazione lipidica
Metanolo	JT Baker	9070-03	Analisi TLC & Estrazione lipidica
Acido acetico	JT Baker	9507-05	Analisi TLC & Estrazione lipidica
Hexanes	JT Baker	9309-02	Analisi TLC & Estrazione lipidica
Dietiletere	Sigma	32203	Saggi enzimatici
acqua bidistillata	QUALSIASI&	nbsp; NA	Saggi enzimatici
Tris Base	Sigma	T-1503	Saggi enzimatici
HCl	Baker	9535-02	Saggi enzimatici
NaCl	Baker	3624-01	Saggi enzimatici
Triton X-100	Sigma	X-100	Saggi enzimatici
LB broth	ANY	NA	Crescita batterica, 10 g triptone + 5 g estratto di lievito + 10 g NaCl per litro di acqua bidistillata
triptone	Becton Dickinson and Company	211705	per la crescita batterica
	Becton Dickinson and Company	212750	Crescita batterica
Brodo TY	ANY	NA	Crescita batterica, 8 g di triptone + 3 g di estratto di lievito + 66 mg di CaCl2· 2H2O per litro di acqua bidistillata
CaCl2· 2H2O	Baker	1332-01	Saggi enzimatici
isopropil-beta;-D-tiogalattoside (IPTG)	Invitrogen	15529-019	Crescita batterica
Dietanolammina	Sigma	D-8885	Saggi enzimatici
MnCl2	Sigma	221279	Saggi enzimatici
Fosfolipasi A2 snake veleno	Sigma	P0790	Saggi enzimatici
Fosfolipasi C Clostridium perfringens	Sigma	P7633	Saggi enzimatici
Bis-p-nitrofenil fosfato	Sigma	07422AH	Saggi enzimatici
p-nitrofenil stearato	Sigma	N3627	Saggi enzimatici
p-nitrofenil dodecanoato	Sigma	61716	Saggi enzimatici
p-nitrofenil decanoato	Sigma	N0252	Saggi enzimatici
p-nitrofenil palmitato	Sigma	N2752	Saggi enzimatici
p-nitrofenil butirrato	Sigma	N9876	Saggi enzimatici
p-nitrofenil ottanoato	Sigma	21742	Saggi enzimatici
Acido acetico, sale sodico [1-14C]	Perkin Elmer	NEC084	Crescita batterica
dimetilsolfossido (DMSO)	JT Baker	9224-01	Saggi enzimatici
Alluminio HPTLC gel di silice 60 piastre. Lastre HPTLC in gel di silice dimensioni 20 x 20 cm, 25 fogli.	Merck	105547	analisi TLC & Spettrometro per estrazione lipidica
UV/VIS Lambda 35	Perkin Elmer	NA	Saggi enzimatici
Storm 820 Phosphorimager	Molecular Dynamics	NA	Scanner a luminescenza fotostimolabile
Contatore a scintillazione multiuso	Beckman Coulter	NA	Quantificazione della radioattività
Cella a pressione francese	ThermoSpectronic	NA	Rottura delle celle
carta per cromatografia 3MM Chr	Whatman	3030917	TLC analysis
Sinorhizobium meliloti 1021il nostro	riferimento 11		ceppo studiato
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Cellule competenti	Novagen	69451	ceppo
pET9a vettore	Novagen	69431	espressione proteica
vettore pET17b	Novagen	69663	vettore di espressione proteica
polistirene sterile provetta a fondo tondo (14 ml) Falcon	Becton Dickinson	352057	radiomarcatura di colture batteriche
provette per microcentrifuga in polipropilene (1,5 ml)	Eppendorf	30125.15	Saggi enzimatici
1,2-dipalmitoil-sn-glicerolo	Sigma	D9135	lipidi standard
L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoil	Sigma	P6267	lipidi standard
DL-&alfa;-monopalmitina	Sigma	M1640	lipidi standard
acido palmitico	Sigma	P0500	lipidi standard