No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Summary

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

A angiogénese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de uma rede vascular pré-existente e ¹ é o foco da pesquisa em curso em muitas áreas, desde o desenvolvimento normal da doença. Este processo dinâmico envolve a proliferação e migração de células endoteliais (ECS) e recrutamento de pericitos para a construção de um tubo vascular que é dirigida para o local que necessita de oxigénio e de nutrientes de entrega ^2. Para estudar este processo requer um ensaio dinâmico igualmente, o mais importante que pode recapitular a natureza tridimensional de formação de tubos. Os ensaios in vitro de matrizes 3D foram desenvolvidos para atender a essa necessidade e têm funcionado bem para permitir que pesquisadores para definir os passos discretos no espaço e no tempo em que a angiogénese ocorre ^{3, 4, 5, 6.} No entanto, estes modelos in vitro de matrizes 3D estão limitadas a estudar navios não-perfundidos umd, por conseguinte, não têm componentes críticos pertinentes para o processo de angiogese (por exemplo, circulando o crescimento e factores inibitórios, a tensão não natural / forças através do leito vascular) e falhar para simular o ambiente complexo presente no tecido vivo. Para resolver esta limitação, vários ensaios in vivo da angiogénese têm sido desenvolvidos ^7, incluindo o ensaio de tampão de gel de matriz, que será o foco do nosso relatório ^{8, 9.}

O ensaio de matriz de tampão de gel é um ensaio in vivo de angiogénese bem estabelecido que atrai pesquisadores, pois proporciona uma plataforma robusta para testar os papéis dos diferentes células e substâncias na angiogênese. gel de matriz é uma membrana basal solução disponível comercialmente que é segregado pela linha celular de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de rato que solidifica em um material semelhante a gel a 37 ° C. A matriz de gel pode ser misturado com as células e / ou substâncias, tais como factores de crescimento, e injected subcutaneamente no mouse. O anfitrião ECs vai invadir a ficha ao longo de 14 dias, formar uma rede vascular, e tornar-se perfusão com sangue do hospedeiro. Até à data, os ensaios camada de gel de matriz têm-se centrado exclusivamente no estudo do comportamento da célula endotelial durante a angiogénese, no entanto, com o melhor de nosso conhecimento nenhum esforço foi feito ainda para determinar se este ensaio pode ser utilizado células endoteliais para co-cultura e pericitos para estudar como estes dois tipos de células interagem durante a angiogênese. Especificamente, a compreensão da relação entre ECs e pericitos é valioso para o estudo de doenças em que a perda de vasos sanguíneos é patológico, incluindo isquemia microvascular e doença vascular periférica ^{10, 11, 12.}

Aqui, nós descrevemos um protocolo que introduz pericitos derivadas de humanos para a mistura de gel da matriz juntamente com ECs humano e factor de crescimento de fibroblastos (bFGF). Esta mistura pode então ser injectado por via subcutânea in o dorso de ratinhos SCID para permitir a formação de pericitos, revestidos, vasos híbridos totalmente funcionais. Nosso protocolo descreve como preparar tampões de gel matriz contendo ECs humanos com ou sem pericitos humanos, colocação em ratinhos SCID e como analisar os cortes histológicos para endpoints angiogênese críticos.

Protocol

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Stanford University School of Medicine. NOTA: Os animais estão sob anestesia com 3% de isoflurano vaporizador e fornecimento 3% de O2 gás. O uso de pomada veterinário nos olhos pode ajudar a prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia. 1. Preparação de células Crescer endoteliais e células pericyte culturas humanas em placas de 100 mm com …

Representative Results

Representante H & E e imunofluorescência coloração das seções camada de gel de matriz são mostrados na Figura 2. Os pontos de CE apenas fichas de exibir alguns vasos que na maioria não são perfundidos com sangue (Figura 2 parte superior esquerda, setas pretas), enquanto fichas contendo tanto ECs e pericitos mostrar vários perfundido vasos com diâmetros maiores e cobertura pericyte completa, como evidenciado por coloração SMA positivo imed…

Discussion

O ensaio de tampão de gel de matriz tem provado ser um método conveniente e poderoso para avaliar a regulação do gene na angiogénese, os compostos angiogénicos e anti-angiogénicos in vivo, e para complementar os testes in vitro. Aqui, descrevemos em detalhe um ensaio tampão de gel matriz novela de angiogênese humana que investiga a interação entre as células endoteliais e pericitos durante a formação de vasos.

Existem alguns passos novos e críticos n…

Materials

PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28G 1cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5mL microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 mL screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907