Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

Summary

Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

L'angiogenesi è il processo attraverso il quale nuovi vasi sanguigni si formano da una rete vascolare preesistente ¹ ed è il centro di ricerca in corso in molti settori che vanno dallo sviluppo normale alla malattia. Questo processo dinamico coinvolge la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali (EC) e reclutamento di periciti per costruire un tubo vascolare rivolta verso il sito che ha bisogno di ossigeno e nutrienti consegna ^2. Per studiare questo processo richiede un saggio altrettanto dinamico, soprattutto uno che può riassumere la natura tridimensionale di formazione del tubo. In vitro matrice 3D sono state sviluppate per rispondere a questa esigenza e hanno lavorato bene per consentire ai ricercatori di definire i passi discreti nello spazio e nel tempo in cui si svolge l'angiogenesi ^{3, 4, 5, 6.} Tuttavia, questi modelli di matrici in vitro 3D sono limitati a studiare i vasi non perfuso und pertanto mancano componenti critici pertinenti al processo di angiogenesi (ad esempio, la crescita e fattori inibitori, tensione innaturale / forze che circola attraverso il letto vascolare) e non riescono a simulare l'ambiente complesso presente nel tessuto vivo. Per far fronte a questa limitazione, diversi saggi di angiogenesi in vivo sono stati sviluppati ^7, tra cui il saggio spina gel matrice che sarà al centro della nostra relazione ^{8, 9.}

Il saggio spina gel matrice è un vivo test consolidata nell'angiogenesi che fa appello a ricercatori in quanto fornisce una solida piattaforma per testare i ruoli delle diverse cellule e sostanze nell'angiogenesi. Gel Matrix è una soluzione membrana basale disponibile in commercio che viene secreto dalla linea cellulare del mouse sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) che si solidifica in un materiale simile a gel a 37 ° C. Il gel matrice può essere miscelata con cellule e / o sostanze, quali fattori di crescita, e injeCTED per via sottocutanea nel mouse. L'host EC invaderà la spina più di 14 giorni, formare una rete vascolare, e diventare perfusi con sangue dell'ospite. Fino ad oggi, le analisi dei plug gel matrice si sono concentrati esclusivamente sullo studio del comportamento delle cellule endoteliali durante l'angiogenesi, tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze nessuno sforzo è stato ancora fatto per determinare se questo test può essere utilizzato cellule endoteliali di co-coltura e periciti per studiare come questi due tipi di cellule interagiscono durante l'angiogenesi. In particolare, la comprensione del rapporto tra EC e periciti è prezioso per lo studio di malattie in cui la perdita dei vasi sanguigni è patologico, tra cui l'ischemia microvascolare e malattia vascolare periferica ^{10, 11, 12.}

Qui, descriviamo un protocollo che introduce periciti di derivazione umana alla miscela di gel matrice con EC umana e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Questa miscela può essere iniettata per via sottocutanea in dorso di topi SCID per consentire la formazione di, rivestito periciti, vasi ibridi completamente funzionale. Il nostro protocollo descrive come preparare i tappi di gel matrice contenente cellule endoteliali umane con o senza periciti umani, il posizionamento in topi SCID e come analizzare le sezioni istologiche per gli endpoint angiogenesi critici.

Protocol

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University School of Medicine. NOTA: Gli animali sono sotto anestesia con il 3% isoflurano vaporizzatore e fornitura 3% di O 2 gas. L'uso del veterinario pomata sugli occhi può aiutare a prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. 1. Preparazione delle cellule Crescere endoteliali e cellule pericyte culture umane in…

Representative Results

Rappresentante H & E e immunofluorescenza colorazione di sezioni spina gel matrice sono mostrati in Figura 2. Sezioni dalla CE solo spine mostrano alcune navi che non sono per lo più perfusi con il sangue (figura 2 in alto a sinistra, frecce nere), mentre le spine contenenti sia EC e periciti visualizzare diverse perfuso navi con diametri maggiori e copertura pericyte completo, come dimostra positivo SMA colorazione immediatamente adiacente alla EC …

Discussion

Il saggio spina gel matrice ha dimostrato di essere un metodo comodo e potente per valutare regolazione genica nell'angiogenesi, composti angiogenici e antiangiogenici in vivo, e per integrare test in vitro. Qui, descriviamo in dettaglio un romanzo spina saggio gel matrice dell'angiogenesi umana che indaga l'interazione tra cellule endoteliali e periciti durante la formazione dei vasi.

Ci sono alcuni punti nuovi e critici in questo protocollo. Le cellule in bass…

Materials

PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28G 1cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5mL microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 mL screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907