की जीनोटाइपिंग<em> स्ताफ्य्लोकोच्चुस</em> द्वारा Ribosomal स्पेसर पीसीआर (RS-पीसीआर)
Summary
Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.
Abstract
The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.
Introduction
Staphylococcus (एस ऑरियस) सबसे महत्वपूर्ण रोगज़नक़ मवेशी 1 में intramammary संक्रमण (आईएमआई) के लिए दुनिया भर में जिम्मेदार के रूप में जाना जाता है। 12 यूरोपीय देशों है कि गायों में Fournier एट अल। 2 स्विस गायों में प्रदर्शन किया और अध्ययन के द्वारा अध्ययन Cosandey एट अल। 3 और बॉस एट अल। 4 से एस ऑरियस गोजातीय से अलग आईएमआई एक आनुवंशिक रूप से विषम समूह है। 16S-23S rRNA intergenic स्पेसर क्षेत्र (RS-पीसीआर) की पीसीआर प्रवर्धन द्वारा, 17 जीनोटाइप की कुल शुरू में 101 epidemiologically स्वतंत्र वियोजन 2 में पाया गया। जीनोटाइप बी और सी जीनोटाइप (जीटीसी), सबसे आम (80%) थे, जबकि अन्य 15 जीनोटाइप (GTS) शायद ही कभी हुआ है, प्रत्येक 1 से 4 सभी वियोजन की% करने के लिए कर रही है। यूरोपीय स्तर 3 में, जीटीबी, जीटीसी, GTF, GTI, और जीटीआर सबसे महत्वपूर्ण सभी का विश्लेषण उपभेदों (एन = 456) के 76% शामिल जीनोटाइप थे। जीटीबी मध्य यूरोप w में स्थित थाhereas अन्य जीनोटाइप व्यापक रूप से प्रचारित किया गया। उपभेदों के शेष 24% 41 जीनोटाइप, उनमें से कई, तथापि, केवल एक बार मनाया गया शामिल थे।
Fournier एट अल। 2, Cosandey एट अल। 3, और Graber एट अल। 5 से पढ़ाई के आगे प्रदर्शन किया है कि जीनोटाइप अत्यधिक उनके डाह जीन पैटर्न के साथ, स्विस पर यूरोपीय स्तर पर के रूप में जुड़े थे और साथ ही साथ। अध्ययनों से आगे एस के बीच आईएमआई प्रसार में भारी अंतर का पता चला ऑरियस जीटीबी, जीटीसी और अन्य जीनोटाइप 2,5: जीटीबी पर विचार, एक झुंड में गायों के 87% अप करने के लिए इस जीनोटाइप से संक्रमित थे। जीटीसी की और अन्य जीनोटाइप के मामले में, हालांकि, आईएमआई केवल एक झुंड के 1 से 2 गायों में मिला था।
आईएमआई एस की वजह से ऑरियस, आम तौर पर इसी स्तन ग्रंथियों की सूजन और दूध में भड़काऊ कोशिकाओं की वृद्धि में परिणाम है। एक परिणाम के रूप में, दैहिक सेल सहदूध में unts (एससीसी), अधिकांश देशों में दूध की गुणवत्ता के प्रमुख सूचक है, एक कम कीमत के दूध या यहां तक कि वितरण बंद करने के लिए अग्रणी बढ़ जाती है।
Fournier एट अल। 2 रुपये पीसीआर के अलावा, अन्य तरीकों टाइपिंग एस के गोजातीय उपभेदों subtyping के लिए वर्णित किया गया है ऑरियस 8-11। दो आम लोगों स्पा टाइपिंग 12 और मल्टी लोकस अनुक्रम टंकण (MLST) 13 में शामिल हैं। पूर्व एक, डीएनए प्रोटीन ए के लिए staphylococcal स्पा जीन कोडिंग के चर स्पेसर क्षेत्र अनुक्रमण के आधार पर है, जबकि बाद एक 7 गृह व्यवस्था जीन का अनुक्रमण की आवश्यकता है। इसका मतलब यह है कि एक 12 और सात PCRs 13, क्रमशः, प्रदर्शन किया जाएगा amplicon शुद्धि, अनुक्रमण प्रतिक्रिया और विश्लेषण विशिष्ट उपकरण का उपयोग करके किया की जरूरत है। RS-पीसीआर की तुलना में, इन तरीकों प्रयोगशाला एक कम नमूना throughput और उच्च लागत में जिसके परिणामस्वरूप में काफी अतिरिक्त प्रयास की आवश्यकता है।throughput PFGE के लिए विशेष रूप से कम है। एस के गोजातीय उपभेदों के लिए इन तरीकों के संकल्प को ध्यान में रखते ऑरियस, रुपये पीसीआर में कम से कम स्पा MLST 4 या PFGE 15 से अधिक 4 और बेहतर टाइपिंग के रूप में अच्छा है।
इन सभी बाइनरी टाइपिंग 13 सहित तरीकों की वजह से एस गोजातीय आईएमआई के रोगजनन में और अधिक जानकारी प्राप्त करने में अपने प्रभाव का प्रदर्शन ऑरियस, लेकिन उल्लेख प्रतिबंध की वजह से वे बड़े चिकित्सीय जांच के लिए कम उपयुक्त हैं। इसके अलावा, रुपये पीसीआर द्वारा जीनोटाइपिंग Fournier एट अल द्वारा वर्णित है। के रूप में 2 महामारी विज्ञान और एस के रोगजनक क्षमता का विश्वसनीय भविष्यवाणी की अनुमति देता है ऑरियस, गोजातीय आईएमआई में शामिल नैदानिक पशु चिकित्सा में दो प्रमुख मूल्यों।
Protocol
Representative Results
Discussion
2 जब वहाँ RS-पीसीआर (> 30 एनजी शुद्ध डीएनए / परख) में डीएनए की एक अतिरिक्त है पूरी प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम है। सामान्य तौर पर, एक प्रोफ़ाइल का संकल्प इष्टतम यदि अपनी चोटियों के सभी आधारभूत से शु?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.
Materials
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw =121.14g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5mol/l | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
Riferimenti
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