genotipagem de<em> Staphylococcus aureus</em> por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) é conhecido como o mais importante agente patogénico responsável a nível mundial para a infecção intramamária (IMI) em bovinos ^1. O estudo realizado por Fournier et al. ² demonstraram em vacas suíças e os estudos por Cosandey et al. ³ e Boss et al. ^4, em vacas de 12 países europeus que S. aureus isolados de bovinos IMI é um grupo geneticamente heterogénea. Por amplificação por PCR de rRNA 16S-23S região espaçadora de intergénica (RS-PCR), um total de 17 genótipos foram inicialmente detectados em 101 isolados independentes epidemiologicamente ^2. Genótipo B eo genótipo C (GTC) eram mais comuns (80%), enquanto os outros 15 genótipos (GTs) ocorreram raramente, cada um fazendo 1 a 4% de todos os isolados. A nível europeu ^3, GTB, GTC, GTF, GTI e GTR foram os genótipos mais importantes que compreendem 76% de todas as cepas analisadas (n = 456). GTB estava situada na Europa Central whereas os outros genótipos foram amplamente divulgados. Os restantes 24% das cepas incluiu 41 genótipos, muitos deles, no entanto, foram observados apenas uma vez.

Os estudos por Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ^3, e Graber et ai. ⁵ ainda demonstrado que os genótipos foram altamente associado com o seu padrão de gene de virulência, bem como no Swiss como a nível europeu. Os estudos revelaram ainda grandes diferenças na prevalência do IMI entre S. aureus GTB, GTC e os outros genótipos de ^2,5: Considerando GTB, até 87% das vacas em um rebanho foram infectados por esse genótipo. No caso de GTC e de outros genótipos, no entanto, o IMI foi encontrado apenas em 1 a 2 vacas de uma manada.

IMI causada por S. aureus, normalmente resulta em inflamação das glândulas mamárias correspondentes e um aumento de células inflamatórias no leite. Como consequência, a co células somáticasunts no leite (SCC), o principal indicador da qualidade do leite na maioria dos países, é aumentada levando a um preço de leite diminuída ou até mesmo parar de entrega.

Além do RS-PCR de Fournier et ai. ^2, outros métodos de tipagem foram descritas para subtipar estirpes de S. bovina aureus ^8-11. Dois dos mais comuns incluem spa digitação ¹² e multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. O primeiro é baseado em sequenciação de ADN da região variável de espaçador do gene que codifica para a proteína Termas de estafilococos A, enquanto que o segundo exige uma sequenciação de 7 genes housekeeping. Isto significa que um e sete ¹² PCRs ^13, respectivamente, têm de ser realizada, seguido por purificação amplicão, reacção de sequenciação e análise utilizando equipamento específico. Em comparação com RS-PCR, estes métodos requerem um considerável esforço adicional no laboratório resultando num rendimento de amostras de baixo e custos elevados. othroughput é particularmente baixa para PFGE. Considerando a resolução destes métodos para as estirpes da espécie bovina de S. aureus, RS-PCR é pelo menos tão boa como spa digitando ⁴ e melhor do que MLST ⁴ ou ¹⁵ PFGE.

Todos estes métodos, incluindo digitação binário ¹³ demonstraram a sua eficácia na obtenção de mais conhecimento sobre a patogênese da bovina IMI causada por S. aureus, mas por causa das restrições mencionadas são menos apropriada para grandes investigações clínicas. Além disso, a genotipagem pela RS-PCR como descrito por Fournier et al. ² permite a previsão fiável do epidemiológica e o potencial patogênico de S. aureus envolvido no IMI bovina, dois valores-chave na medicina veterinária clínica.

Protocol

1. Staphylococcus aureus Espalhe 10 ul de S. aureus cultura de reserva ou uma colónia crescida em meio selectivo em placas de agar de Columbia contendo 5% de sangue de carneiro (BA). Incubar aerobicamente a 37 ° C durante 18 h a 24 h. 2. Extração de DNA Preparar tampão TEL contendo Tris-HCl 10 mM e 10 mM de Na 2 EDTA, pH 8,5. Preparar alíquotas e autoclave a 121 ° C durante 15 min. Recolha 1 colónia…

Representative Results

Definição de um genótipo e suas variantes Um perfil electroforético que difira em mais do que uma banda de todos os genótipos identificados é considerado como um novo genótipo. Novos genótipos são nomeados e ampliado de acordo com a Fournier et al. 5 levando aos genótipos GTA a GTZ, seguido pelos genótipos GTAA para GTAZ e GTBA para GTBZ e GTCA para GTCC no presente. Variação em apenas uma faix…

Discussion

O passo mais importante de todo o processo é quando há um excesso de ADN de RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensaio puro) ^2. Em geral, a resolução de um perfil é ideal se todos os seus picos de começar e terminar na linha de base. Se dois picos são muito próximos, a resolução é incompleto. Sob estas condições, o software Bioanalyzer inadequado pode levar ao pico de identificação de modo a que é requerida uma identificação manual.

Todos os picos visivelmente separadas …

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'