genotipado de<em> Staphylococcus aureus</em> por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) se conoce como el patógeno más importante en todo el mundo responsable de la infección intramamaria (IMI) en el ganado ^1. El estudio realizado por Fournier et al., ² demostrado en las vacas suizas y los estudios realizados por Cosandey et al. ³ y de Boss et al. ⁴ en vacas de 12 países europeos que S. aureus aislado de bovino IMI es un grupo genéticamente heterogéneo. Mediante amplificación por PCR de la región espaciadora intergénica 16S-23S rRNA (RS-PCR), un total de 17 genotipos se detectaron inicialmente en 101 aislamientos epidemiológicamente independientes ^2. El genotipo B y C de genotipo (GTC) fueron más comunes (80%), mientras que los otros 15 genotipos (SMT) se produjeron en raras ocasiones, cada uno haciendo del 1 al 4% de todos los aislamientos. A nivel europeo ^3, GTB, GTC, GTF, GTI, y GTR fueron los genotipos más importantes que comprenden el 76% de todas las cepas analizadas (n = 456). GTB se encuentra en el centro de Europa wientras los otros genotipos se difundieron ampliamente. El 24% restante de las cepas incluyó 41 genotipos, muchos de ellos, sin embargo, se observaron sólo una vez.

Los estudios realizados por Fournier et al., ^2, Cosandey y col. ^3, y Graber et al. ⁵ demostraron además que los genotipos fueron altamente asociados con su patrón de genes de virulencia, así como en el suizo como a nivel europeo. Los estudios revelaron diferencias más grandes en la prevalencia entre IMI S. aureus GTB, GTC y los otros genotipos ^2,5: Teniendo en cuenta GTB, hasta el 87% de las vacas de un rebaño se infectaron por este genotipo. En el caso de GTC y de los otros genotipos, sin embargo, IMI fue sólo se encuentra en 1 a 2 vacas de un rebaño.

IMI causada por S. aureus, normalmente resulta en la inflamación de las glándulas mamarias correspondientes y un aumento de células inflamatorias en la leche. Como consecuencia de ello, la co células somáticasunts en la leche (SCC), el indicador clave de la calidad de la leche en la mayoría de los países, se incrementa dando lugar a una disminución del precio de la leche o incluso detener la entrega.

Además de la RS-PCR de Fournier et al. ^2, se han descrito otros métodos de tipificación para subtipificación cepas bovinas de S. aureus ^8-11. Dos de los más comunes incluyen la tipificación spa de ¹² y Multi Locus Secuencia Typing (MLST) ^13. El primero de ellos está basado en el ADN secuenciación de la región espaciadora variable del gen que codifica para la proteína de spa estafilocócica A, mientras que el segundo se requiere la secuenciación de los genes de limpieza 7. Esto significa que un ¹² y siete PCRs ^13, respectivamente, necesitan ser realizados, seguido de purificación amplicón, reacción de secuenciación y el análisis utilizando equipo específico. En comparación con RS-PCR, estos métodos requieren un esfuerzo adicional considerable en el laboratorio que resulta en un flujo de muestras de bajo y altos costos. losel rendimiento es especialmente baja en el PFGE. Teniendo en cuenta la resolución de estos métodos para las cepas de la especie bovina de S. aureus, RS-PCR es por lo menos tan bueno como spa escribir ⁴ y mejor que MLST ⁴ o PFGE ^15.

Todos estos métodos que incluyen la tipificación binaria ¹³ demostraron su eficacia en la obtención de una mayor comprensión de la patogénesis de la IMI bovina causada por S. aureus, pero debido a las restricciones mencionadas son menos apropiados para grandes investigaciones clínicas. Además, la genotipificación por RS-PCR como se describe por Fournier et al. ² permite la predicción fiable de la epidemiológica y el potencial patógeno de S. aureus involucrado en el IMI bovina, dos valores clave en la medicina veterinaria clínica.

Protocol

1. aislados de Staphylococcus aureus Spread 10 l de S. aureus cultivo madre o una colonia crecida en un medio selectivo en placas de agar Columbia que contenían 5% de sangre de oveja (BA). Incubar aeróbicamente a 37 ° C durante 18 horas a 24 horas. 2. Extracción de ADN Preparar tampón TEL que contiene Tris-HCl 10 y 10 mM Na 2 EDTA, pH 8,5. Preparar alícuotas y autoclave a 121 ° C durante 15 min. Reco…

Representative Results

Definición de un genotipo y sus variantes Un perfil electroforético que difieren en más de una banda de todos los genotipos identificados se considera como un nuevo genotipo. Nuevos genotipos se nombran y se extendieron acuerdo con Fournier et al. 5 que conduce a los genotipos de GTA a la GTZ, seguido de los genotipos GTAA a GTAZ, y GTBA a GTBZ, y al GTCA GTCC en la actualidad. Variación en sólo una ba…

Discussion

El paso más crítico de todo el procedimiento es cuando hay un exceso de ADN en RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensayo puro) ^2. En general, la resolución de un perfil es óptimo si todos sus picos de inicio y fin en la línea de base. Si dos picos están demasiado juntos, la resolución es incompleta. En estas condiciones, el software Bioanalyzer puede conducir a la identificación de los picos apropiado de manera que se requiere la identificación manual.

Todos los picos visiblemen…

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'