bir Genotiplendirme<em> Staphylococcus aureus</em> Tarafından Ribozomal Spacer PCR (RS-PCR)

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) sığır ¹ meme içi enfeksiyon (IMI) dünya çapında sorumlu en önemli patojen olarak bilinir. 12 Avrupa ülkesinde bunun ineklerde Cosandey ve ark., ³ ve Boss ve diğ. ⁴ tarafından Fournier ve ark. ² İsviçre ineklerde gösterdi ve çalışmalarla çalışma S. aureus IMI genetik olarak heterojen bir grup büyükbaş izole. 16S-23S rRNA intergenik aralayıcı bölge (RS-PCR), PCR amplifikasyonu ile, 17 genotip toplam başlangıçta 101 epidemiyolojik bağımsız izolatların ² tespit edilmiştir. Diğer 15 genotipleri (GTs) her 1 tüm izolatların% 4, yapım nadiren meydana oysa Genotip B ve genotip C (GTC), (% 80) en sık görülen idi. Avrupa ^3. seviyede, GTB, GTC, GTF, GTI ve GTR tüm analiz suşları (n = 456)% 76 içeren en önemli genotipleri vardı. GTB w Orta Avrupa'da yer alıyorduhereas diğer genotip yaygın dağıtılmıştır. Suşların kalan% 24 birçoğu, ancak, sadece bir kez gözlendi 41 genotipleri dahil.

Genotipleri çok Avrupa düzeyinde olduğu Swiss'te yanı sıra, onların virülans gen modeli ile ilişkili olduğunu Fournier ve ark. ^2, Cosandey vd. ³ ve Graber vd. ⁵ ile çalışmalar daha gösterdi. Çalışmalar daha S. arasında IMI prevalansının büyük farklılıklar ortaya aureus GTB, GTC ve diğer genotipleri ^2,5: GTB dikkate alınarak, bir sürüdeki ineklerin% 87'ye kadar bu genotip ile enfekte edildi. GTC ve diğer genotiplerinin durumda, ancak, IMI sadece sürünün 1 ila 2 ineklerde tespit edildi.

IMI S. neden aureus, normal gelen meme bezlerinin iltihaplanması süt iltihaplı hücrelerin bir artış ile sonuçlanır. Bunun bir sonucu olarak, somatik hücre koSütteki unts (SCC), çoğu ülkede süt kalitesinin önemli bir göstergedir, azalan süt fiyatı ya da teslim durağına giden artar.

Fournier ve ark., ² RS-PCR yanı sıra, diğer yazma yöntemleri S. sığır suşları alt tiplerinin için tarif edilmiştir aureus ^8-11. İki ortak olanları spa yazarak ¹² ve Multi Odağı Sırası Yazma (MLST) ¹³ içerir. Ikinci bir 7 hazırlık geninin sıralama gerektirir, oysa önceki bir protein A stafilokok Spa kodlayan genin değişken aralayıcı bölgesini DNA dizilimi dayanır. Bu, bir ¹² ve yedi PCR ^13, sırasıyla özel ekipman kullanılarak amplikon saflaştırma, sıralama reaksiyonunun ve analiz, ardından yapılması gerektiği anlamına gelir. RS-PCR ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, düşük seviyede örnek ve yüksek maliyetleri ile sonuçlanan laboratuarda önemli bir ek bir çaba gerektirir.verim PFGE için özellikle düşüktür. S. sığır suşları için bu yöntemlerin çözünürlüğü göz önüne alındığında aureus, RS-PCR, en azından MLST ⁴ veya PFGE ¹⁵ den ⁴ ve daha iyi yazarak spa kadar iyidir.

İkili yazma ¹³ dahil olmak üzere tüm bu yöntemler S. neden sığır IMI patogenezinde içine daha fazla bilgi elde etkinliğini gösterdi aureus, ancak çünkü söz konusu kısıtlamalar onlar büyük klinik araştırmalar için daha az uygundur. Buna ek olarak, RS-PCR yöntemi ile genotipleme Fournier ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi. ² epidemiyolojik ve S patojenik potansiyeli güvenilir bir tahmin sağlar aureus, sığır IMI klinik veteriner hekimlikte iki anahtar değerleri çıkıyor.

Protocol

1. Staphylococcus aureus izolatları S. 10 ul yayıldı aureus hazır bir kültür veya bir koloni,% 5 koyun kanı (BA) içeren Kolumbiya agar plakaları üzerinde seçici bir ortam üzerinde büyütülür. 24 saat için 18 saat, 37 ° C 'de aerobik inkübe edin. 2. DNA Ekstraksiyon 10 mM Tris-HCl ve 10 mM Na2EDTA, pH 8.5 ihtiva eden TEl tamponu hazırlayın. 15 dakika boyunca 121 ° C'de alikotları…

Representative Results

Bir genotip ve türevleri tanımı belirlenen tüm genotipler birden fazla bant farklı bir elektroforetik profilini yeni genotip olarak kabul edilir. Yeni genotipleri adlandırılır ve genişletilmiş Fournier ve diğerlerine göre. 5 GTAZ genotiplerin GTAA ardından GTZ genotiplerin GTA giden ve GTBA GTBZ için ve GTCC için GTCA düzeydedir. sadece bir bant değişimin, bir genotip bir varyasyon olarak …

Discussion

RS-PCR (> 30 saf DNA / tahlil ng) 'de DNA' sının aşırı olduğunda bütün prosedürün en kritik adımdır ^2. Bunu tüm tepe başlangıçta başlangıç ​​ve bitiş Genel olarak, bir profilin çözünürlüğü en uygunudur. iki tepe birbirine çok yakın ise, çözünürlük eksik. kılavuzu tanımlama gerekli olduğu şekilde, bu koşullar altında, Bioanalyzer yazılımı olmayan pik tanımlanmasına yol açabilir.

bp veya FU olarak ifade edilen tüm gözle …

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'