Inducerande Komplett Polyp Regenerering från Aboral physa av Nematostella vectensis<em> Nematostella vectensis</em

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Cnidarians, och särskilt Hydra, var de första djuren visade att regenerera skadade eller avslitna strukturer, och faktiskt sådana undersökningar utan tvekan lanserat modern biologisk undersökning genom arbetet i Trembley mer än 250 år sedan. Närvarande studiet av regenerering har sett ett uppsving med hjälp av både "klassiska" regenerativa organismer, såsom Hydra, planaria och Urodeles, samt en breddning spektrum av arter som sträcker sig över området av metazoer, från svampar genom däggdjur. Förutom dess inneboende intresse som ett biologiskt fenomen, kommer att förstå hur regenerering fungerar i en mängd olika arter informera oss om huruvida regenerativa processer har gemensamma funktioner och / eller arter eller kontextspecifika cellulära och molekylära mekanismer. Starlet havsanemon, nematostella vectensis, är ett växande modellorganism för regenerering. Liksom Hydra, är nematostella en medlem av den gamla stammen, cnidaria, men inom than klassen Anthozoa, en syster klad till hydrozoa som är evolutionärt mer basala. Således aspekter av förnyelse i nematostella ska bli intressant att jämföra och kontrastera med de Hydra och andra nässeldjur. I den här artikeln presenterar vi en metod för att Bisect, observera och klassificera regenerering av aboral änden av nematostella vuxen, som kallas physa. Den physa undergår naturligt klyvning som ett medel för asexuell reproduktion, och antingen naturliga klyvning eller manuell amputation av physa utlöser återväxt och reformation av komplexa morfologier. Här har vi kodifierat dessa enkla morfologiska förändringar i nematostella Regeneration Staging System (den NRSS). Vi använder NRSS att testa effekterna av klorokin, en hämmare av lysosomal funktion som blockerar autophagy. Resultaten visar att regenereringen av polyp strukturer, i synnerhet de mesenteries, är onormal när autophagy inhiberas.

Introduction

Observationen av förnyelse i en enda hydra var det nyskapande händelse i tillkomsten av biologi som en experimentell vetenskap ^1,2. Regenerering är fortfarande ett fenomen av utomordentligt bred vädjan till biolog och lekman lika. Potentialen för utvecklings biologer, kliniker, biomedicinska analytiker och vävnads ingenjörer att förstå och övervinna gränserna för mänsklig förnyelse gör regenerering biologi mer än egen intressant.

Nu, med hjälp av ny teknik, såsom genomsekvensering och vinst och förlust av funktionsverktyg är fältet redo att retas isär regenerativa mekanismer och att slutligen förstå hur olika arter kan regenerera medan andra inte kan. Graden av gemensamhet i molekylära, cellulära och morfologiska svar återstår att klarlägga, men hittills verkar det som de grundläggande reaktioner bland djur som kan regenerera är mer lika än vad som skulle ha varit imagiNed bara ett decennium sedan ^tre.

Nässeldjur i synnerhet är enkel på att regenerera nästan alla sina kroppsdelar bland ett brett spektrum av morfologisk mångfald. Från den ensamma färskvatten polyp, Hydra tillsammans med de små marina polyper som bygger enorma korallrev, till de komplexa koloniala Siphonophor, såsom den portugisiska Man-O-War, är regenere ofta en form av reproduktion, förutom en mekanism för reparera eller reformera skadade eller förlorade kroppsdelar till följd av skada och predation. Om de olika arter av Cnidaria använder liknande eller olika mekanismer för regenerering är en principiellt intressant fråga ^4-6.

Vi och andra har varit att utveckla den KORALLDJUR, vectensis nematostella som en modell för regenerering ^7-17. Vi utvecklade nyligen en mellanstation system för att beskriva regenerering av en hela kroppen från en morfologiskt enhetlig bit vävnad tudelas från Aboral slutet av polyp ^10. Medan nematostella polyper kan regenerera när tudelas på alla nivåer, valde vi att skära vuxna i en aboral position i de morfologiskt enkla regionen, physa, delvis eftersom det är nära till normalplanet av naturliga asexuell fission ^18, och också eftersom det tillåter observation och molekylära analyser av hur en hel kropp ihop från de enklaste morfologiska komponenter.

Den nematostella Regeneration Staging System (NRSS) ger en relativt enkel uppsättning morfologiska riktmärken som kan användas för att göra mål utvecklingen av någon aspekt av regenerering av en amputerad physa under normala odlingsbetingelser eller experimentellt störs situationer som småmolekylära behandlingar, genmanipulation eller miljö förändring. Som väntat är NRSS bli antagen som en morfologisk byggnadsställning som de cellulära och molekylära händelser förnyelse kan refereras10.

Slutligen vår metod för skärning ger ett gapande hål flera tiopotenser större än sällade punktering som används i en nyligen genomförd studie ^17, men båda sår läker i cirka 6 timmar. Dokumentera visuellt gripa och distinkta faser av sårtillslutning bör föreslå experimentella metoder för att förklara den skenbara oberoende av storleken på ett sår och den tid det tar att stänga. Således, en djupare visuell förståelse för aboral amputation processen, som tillhandahålls av detta protokoll kommer att hjälpa ytterligare undersökningar i denna modell regenereringssystem och bredda tillämpningen av denna iscensättning system med nematostella vectensis.

Protocol

1. Konditionering av djur för temperatur, näring och ljus / mörkercykel Skaffa nematostella vectensis vuxna från en av de många nematostella labb världen över, eller en ideell leverantör (tabell 1) Bibehålla nematostella vid konstant temperatur (typiskt mellan 18 och 21 ° C) i mörker, i "1 / 3x" artificiellt havsvatten (ASW) vid en salthalt av 12 delar per tusen (ppt). Bibehålla kulturer i enkla sodaglasodlingsskålar, typiskt 250 ml …

Representative Results

Progressionen av morfologiska händelser under regenerering i avhuggna physa visas i figur 1 A, som inkluderar representativa vyer av physa vid varje NRSS skede. Den typiska physa snitt webbplats visas på vuxna (pilspetsar). Fotografierna i figur 1A visar progressiv förnyelse av orala och kroppsstrukturer från nyklippt physa genom fullt utvecklade polyp. Figur 1B, C visar arrangemanget av interna septa, de mesenteries, i steg 4 och st…

Discussion

Användning av nematostella som en modell för sårläkning och regenerering blir alltmer populärt. Således är det viktigt att kunna visualisera de morfologiska mönster av ett särskilt protokoll före effektiva cellulära och molekylära analyser kan tilldelas och jämföras. Nematostella har en hög grad av regenerativ "flexibilitet", att kunna reformera nästan alla saknade struktur amputerad på valfri plats, vid post planula skeden av livet. Sålunda har olika forskare undersökt reg…

Materials

Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml	Carolina Biological Supply	741004	250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml	Carolina Biological Supply	741006	1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 – 40x magnification