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Ambiente

実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム

Published: October 09, 2017
doi:
10.3791/54631
, , , , ,
1Vegetable Crop Research Unit,USDA-ARS, 2Department of Entomology,University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture,University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology,University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics,Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center,Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution,University of Wisconsin-Madison

Summary

マルハナバチ巣箱内微生物コンソーシア豊かにし、ハチの幼虫のため花粉を維持します。研究室と実験、フィールド ベースの次世代シーケンシングによるこの原稿は殺菌剤残留物変更、花粉マイクロバイ オームおよびコロニーの人口統計、コロニーに繋がること仮説をテストするために使用されるプロトコルについて説明します損失。

Abstract

生産者は、しばしば病は、殺菌剤残留物に蜂を公開に対する作物を保護するために花の中に殺菌剤散布を使用します。「蜂-安全」と考えられるが、花粉で殺菌剤の残留物が (蜂蜜とバンブレ蜂種) の蜂の減少に関連付けられている証拠があります。メカニズムは比較的知られていないまま、研究者は、蜂と微生物の共生が関与していることを推測しています。微生物は、保全や蜂の幼虫の栄養となる花粉の処理に重要な役割を再生します。微生物群集を変更すると、殺菌剤これらの微生物を介したサービスを妨害、ミツバチの健康危険にさらされる可能性が。本稿では、間接機構、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。殺菌剤処理の花に蜂を公開ケージの実験は既に殺菌剤がネイティブ熊蜂 (マルハナバチ インパチェンス) で深遠な植民地の損失を引き起こすという最初の証拠を提供しています。殺菌剤のフィールドに関連する線量を使用して、一連の実験は、殺菌剤にさらされた花粉群集動態の細かい説明を提供するために開発されています。次世代シーケンサーとメタゲノム解析、花粉マイクロバイ内真菌と細菌群集の構造の組成の変化を調べた。ここを開発した実験は、殺菌剤が花粉規定のマイクロバイにどのような影響を与えるかの機械的な理解を提供するために設計されています。最終的には、これらの調査結果は、間接的な経路、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性に光を当てる必要があります。

Introduction

管理し、野生ハナバチの種は、両方の自然と農業システムの1の主要な意味を持つ、広範な低下を経験しています。この問題の原因を理解するための努力にもかかわらず蜂蜜ミツバチ減少の要因はまだよく理解されて2,3,4。野生では、ネイティブのミツバチの特定の種、状況は悲惨な5,6になりました。産業としての農業と交差する、彼らの人口は、秋に引き続き、花粉 (世界生産の7の 35%) を必要とする作物に耐えるだろうとミツバチの人口を維持できない場合は、収穫を削減しました。

蜂蜜蜂の減少、農薬の露出、病気、および生息地の損失1,4,8,9,10など多くの潜在的な要因が関与しているとき比較的少しネイティブ蜂健康、または農業システムの近くにこれらのストレスのインタラクティブな効果について知られています。多くの現在の研究努力は、過去の研究を示していますが殺菌剤が蜂の低下で、記憶形成を損なうことによって役割再生も殺虫剤、(例えば、ネオニコチノイド11,12) に注力していきます嗅覚フロント13、巣認識14、酵素活性、代謝機能15,16,17。グローバルに、殺菌剤は満開で開花作物に適用し続けます。最近の研究は、蜂はよく戻るハイブに18、確かに殺菌剤残留物をもたらす、研究が含まれているテストのハイブ殺菌剤の残留19,20の大きい割合を示していることを記載しています。その殺菌剤の残留率が高い蜂蜜蜂幼虫死亡率21,22,23とコロニー内で「花粉の埋葬」の存在に関連付けられてそれ以上の仕事は明らかにするが、無毒微生物活性を欠いているし、栄養学的危害を受けた24です。殺菌剤「蜂セーフ」が考慮されて長いことにもかかわらず、証拠は今単独で殺菌剤への曝露ネイティブ バンブレ蜂種25マルハナバチ インパチェンスの深刻な植民地損失を引き起こす可能性が。

殺菌剤暴露と植民地との間の因果関係を確立するには、死亡率、これらの化学物質の手口を決定する必要があります。土26、堆積物中の27日、水生環境28菌をターゲットによって証明される、最も可能性の高い殺菌剤変更真菌豊富と花粉規定、それにより主要なコミュニティを呼び出す内の多様性をシフトします。細菌を強く支持可能性があります。真菌の競合他社や拮抗薬、病原性の細菌は比較的オフ、花粉規定の腐敗を促進する増殖できます。過去の研究は実証、微生物、酵母や糸状菌、特に蜂29,30,31栄養共生として、寄生虫および病原体32 からの保護 ,33, 花粉店の長期保存を提供。防かび剤、したがって、直接害を与えるかもしれないない未熟な蜂がこれらのサービスを提供するために必要な微生物群集を混乱させることによっておよび/または日和見主義の病原体や寄生虫12への感受性を高めることによって。食料生産の需要増加に伴い、世界中の作物がされて毎年殺菌剤を噴霧ブルームは、このような殺菌剤による影響の大きさを理解する必要性を強調する中に。

まで、主な知識のギャップに関するネイティブ蜂微生物生態学は次の質問によって表すことができる:どの程度は殺菌剤変更蜂花粉規定内の微生物コミュニティ?深く変えられた群集で花粉を消費の下流への影響は何ですか?これらの生態学的関係の質問を維持し、実験は、明らかに 1 の主な目標で開発された) 単独でその殺菌剤残渣ネイティブ蜂種; 重度のコロニーの低下を引き起こす可能性が2) 殺菌剤、および 3 によって変更されます花粉規定の微生物群集する程度) ミツバチの健康の深刻な変更された微生物群集による影響します。実験の目的は、実験室およびフィールド ベースの組み合わせを使用して上記の質問に対処するため定義されました。新式のメタゲノムと従来のフィールド観測の方法と一緒に分子技術を使用して、この研究はミツバチの健康に対する薬剤の潜在的な効果を一緒に作品を目指しています。

本研究の第一の目的は、殺菌剤暴露のみでネイティブ蜂種の間で重要な植民地の損失を引き起こす可能性を示すことです。大規模なフィールドのケージを含む研究は、マルハナバチ インパチェンス米国 (図 1図 2図 3) で、ユビキタス、豊富なネイティブ蜂のコロニーの成長に及ぼす殺菌剤曝露の調査に使用されました。殺菌剤処理じんましんであれば、低いフィットネスと非曝露ハイブと比較して非定型の人口統計、仮説。この実験から得られたデータは、花粉内の殺菌剤の残留物がネイティブ バンブレ蜂種25で深遠な植民地の損失の唯一の原因をすることができますを示す、この仮説をサポートされています。本研究の第二の目的は、殺菌剤の曝露に花粉マイクロバイの応答を調査するためです。それは、殺菌剤にさらされる花粉規定内微生物の群集構造が異なる未処理花粉のこと仮定されます。真菌の豊かさと多様性を期待して、大幅に低下する、細菌および/または単一の支配的な真菌種可能性が大きくなります他の競合する菌の有無のチェック。一連の生体内試験、メタを使用してこれらの微生物群集組成の変化を分析します。

Protocol

1。 バンブレ蜂コロニーの成功を使用してフィールド ケージ実験に殺菌剤曝露の効果を調べる フィールドで を 10 セット メッシュ ケージは麦が植えられました。各ケージの周りトレンチを掘るし、蜂が逃れることができないように地面にメッシュ ケージの 4 つすべてのエッジを掘る。ハチ (例えば ソバ、ルリヂサ、ミヤマナズナ属、コスモス、ひまわり) を知られている、鉢…

Representative Results

ケージ調査: ケージの実験から得られたデータは、マルハナバチのミツバチのコロニーが殺菌剤の暴露に重要な応答を持っていたことを示した。殺菌剤処理ハイブ生産コントロールのじんましんよりも大幅に少ない労働者 (12.2 ± 3.8、平均 ± SE) (43.2 ± 11.2,= 6.8 F1, 9, p = 0.03) (図 4</stron…

Discussion

ミツバチの健康に対する薬剤の効果への調査は、害虫管理戦略の流面を残っています。ミツバチ減少の潜在的な要因を明示的に分離する相補的な技術のスイートを使用して、この知識のギャップを埋めることを目指します。計画、理論的根拠、およびこれらの実験のレンダリングは次のとおりです。

この人口統計学の分析を損なわれてしまいますので、ケージを用いた?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者に感謝に関する技術的な支援を提供するため増幅とシーケンス処理設備とサービス、ケイトリン カールソン、ジェニファーのコツ、ジェイク オットー、マックス Haase を提供するウィスコンシン大学バイオ テクノロジー センター DNA シーケンスの施設分子分析。この作品は、米国農務省農業研究サービス充当資金 (現在研究情報システム #3655-21220-001) によって支えられました。これ以上のサポートは (グラント号下の国立科学財団によって提供されました。DEB-1442148)、DOE グレイト レイクス バイオ エネルギー研究センター (科学 BER デ-FC02-07ER64494 の DOE のオフィス)、および米国農務省農業研究所と農業 (ハッチ プロジェクト 1003258)。C.T.H. は医科学とそれぞれピュー慈善信託とアレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト財団によってサポートされて、アルフレッド Toepfer の教員仲間でピュー学者です。

Materials

Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR
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Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).
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