Empirisk, Metagenomic og beregningsorientert teknikker belyse mekanismer av hvilke soppmidler kompromiss Bee helse

Summary

Mikrobiell konsortier innen bumble bee elveblest berike og bevare pollen for bee larver. Med neste generasjons sekvensering, laboratorium og feltbaserte eksperimenter, beskriver dette manuskriptet protokoller brukes til å teste hypotesen at soppdreper rester endre pollen microbiome, og kolonien demografi, slutt fører til koloni tap.

Abstract

Bøndene bruker ofte soppdreper spray under blomst for å beskytte avlinger mot sykdom, som eksponerer bier til soppdreper rester. Selv om betraktet som “bee-sikker”, er det montering bevis at soppdreper rester i pollen er forbundet med bee synker (for både honning og bumble bee arter). Mens de fortsatt relativt ukjent, spekulert forskere at bee-mikrobe symbioses er involvert. Mikrober spille en sentral rolle i bevaring og/eller behandling av pollen, som fungerer som næring for larver bier. Ved å endre mikrobiell samfunnet, er det sannsynlig at soppmidler forstyrre mikrobe-mediert tjenester, og dermed kompromittere bee helse. Dette manuskriptet beskriver protokollene som brukes å undersøke den indirekte mechanism(s) som soppmidler kan forårsake kolonien nedgang. Buret eksperimenter utsette bier til soppdreper-behandlet blomster har allerede gitt det første beviset at soppmidler forårsake dyp kolonien tap i en innfødt humlen (liten impatiens). Bruker feltet relevante doser av soppmidler, en serie eksperimenter er utviklet for å gi en bedre beskrivelse av mikrobielle samfunn dynamikken i soppdreper-eksponerte pollen. Endringer i strukturelle sammensetningen av sopp og bakteriell samlinger i pollen microbiome blir etterforsket av neste generasjons sekvensering og metagenomic analyse. Eksperimenter utviklet her er utformet for å gi en mekanistisk forståelse av hvordan soppmidler påvirker microbiome pollen-bestemmelser. Til slutt, disse funnene bør kaste lys over indirekte veien som soppmidler kan forårsake kolonien avtar.

Introduction

Klart og vill bee arter opplever utbredt nedgang, med store konsekvenser for både naturlig og landbruket¹. Til tross for felles innsats for å forstå årsakene til problemet, er faktorene som driver honey bee nedgangen fortsatt ikke godt forstått^2,3,4. For enkelte arter av vill, innfødt bier, har situasjonen blitt dire^5,6. Hvis bee befolkninger ikke kan opprettholdes når de snitter industrielle landbruket sine befolkninger vil fortsette å falle og avlinger som krever pollinators (35% av verdensomspennende produksjon⁷) vil tåle redusert avlinger.

Mens mange potensielle faktorer som plantevernmidler eksponering, har sykdom og habitat tap^1,4,8,9,10 vært innblandet i honey bee nedgang, relativt er lite kjent om interaktive effekten av disse stressorer på innfødt bier helse, i eller i nærheten av jordbruks-systemer. Mange nåværende forskningsinnsats fortsette å fokusere på insektmidler, (f.eks, neonicotinoids^11,12), selv om tidligere forskning indikerer at soppmidler kan også spille en rolle i bee nedgang ved å svekke minne formasjon, olfactory resepsjonen¹³, reir anerkjennelse¹⁴, enzym aktivitet og metabolske funksjoner^15,16,17. Globalt, fortsatt soppmidler brukes til blomstrende avlinger under blomst. Nyere studier har dokumentert at bier vanligvis bringe soppdreper rester tilbake til strukturen¹⁸, faktisk, studier har vist en stor andel av testet elveblest inneholdt soppdreper rester^19,20. Videre arbeid har avslørt at soppdreper rester er knyttet til høy forekomst av honey bee larver dødelighet^21,22,23 og tilstedeværelsen av “innkapslede pollen” i kolonier, som selv om ikke-giftig, er blottet for mikrobiell aktivitet og ernæringsmessig kompromittert²⁴. Til tross for at soppmidler har lenge vært ansett “bee-sikker”, det er nå bevis for at eksponering for soppdreper alene kan forårsake alvorlige kolonien tap i innfødt bumble bee Art, Bombus impatiens²⁵.

For å etablere årsakssammenheng mellom soppdreper eksponering og kolonien dødelighet, den modus operandi av disse kjemikaliene skal bestemmes. Som dokumentert i jord²⁶, sedimenter²⁷og akvatiske miljøer²⁸, av målretting sopp, soppmidler mest sannsynlig endre fungal overflod og mangfold i pollen-bestemmelser, og dermed starter et større fellesskap Skift som kan sterkt favorisere bakterier. Uten fungal konkurrenter eller antagonister, kan visse patogene bakterier spre relativt ukontrollert, tilrettelegge kvalitetsforringende pollen-bestemmelser. Tidligere forskning har vist at mikroorganismer, spesielt gjær og trådformede sopp, tjene som ernæringsmessige symbionter for bier^29,30,31, beskytte mot parasitter og patogener^{32 ,33}, og gi langtidsoppbevaring av pollen butikker. Fungicides, derfor kan indirekte skade umodne bier ved å forstyrre det mikrobielle samfunnet som er nødvendig for å yte tjenester og/eller økt mottakelighet for opportunistiske patogener og parasitter¹². Med økende krav til matproduksjon, er avlinger verden er sprøytet hvert år med soppmidler under bloom, understreker behovet for å forstå omfanget av slike soppdreper-indusert effekter.

Til dags dato, primære kunnskapshull knyttet til innfødte bee mikrobiell økologi kan representeres av følgende spørsmål: i hvilken grad soppdreper endrer det mikrobielle samfunnet i bee pollen-bestemmelser? Hva er nedstrøms konsekvensene av å konsumere pollen med et dypt endret mikrobielle samfunn? I tråd med spørsmålene økologisk germane, eksperimenter ble utviklet med de primære mål å avsløre 1) at soppdreper rester alene kan forårsake alvorlige kolonien nedgang i en innfødt bee Art; 2) graden som mikrobielle samfunn i pollen-bestemmelser er endret av soppmidler og 3) hvordan bee helse påvirkes av et sterkt endret mikrobielle samfunn. Eksperimentell målene ble definert for å løse de ovennevnte spørsmålene en kombinasjon av laboratorie – og feltbaserte eksperimenter. Ved hjelp av state-of-the-art metagenomic og molekylære teknikker sammen med tradisjonelle metoder for feltet observasjon, skal denne forskningen sette sammen de potensielle effektene av soppmidler på bee helse.

Det første målet av denne studien er å vise at soppdreper eksponering alene kan forårsake betydelig kolonien tap blant innfødt bee arter. En studie som involverer store feltet burene ble brukt til å undersøke virkningene av soppdreper eksponering på kolonien veksten av liten impatiens, en allestedsnærværende, rikelig innfødt bie i USA (figur 1, figur 2, Figur 3). Var hypotesen at soppdreper-behandlet elveblest ville presentere lavere fitness og atypisk demografi sammenlignet med ikke-utsatt elveblest. Data fra dette eksperimentet støtter denne hypotesen, demonstrere at soppdreper rester i pollen kan være den eneste årsaken til dyp kolonien tap i en innfødt bumble bee arter²⁵. Det andre målet av denne studien er å undersøke respons på pollen microbiome soppdreper eksponering. Det er en teori om at samfunnet sammensetningen av mikrober innen pollen klargjør utsatt for soppmidler vil være forskjellig fra ubehandlet pollen. Mens fungal overflod og mangfold ventes å avta betydelig, vokse bakterier og/eller en enkelt dominerende fungal arten sannsynligvis ukontrollert i fravær av andre konkurrerende sopp. Gjennom en rekke i vivo prøvelser, vil disse skift i mikrobielle samfunn komposisjon analyseres ved hjelp av metagenomics.

Protocol

1. undersøke effekten av soppdreper eksponering på Bumble Bee kolonien suksess ved hjelp av feltet bur eksperimenter Sett opp ti mesh bur i et beplantet med havre. Grave en grøft rundt hver bur, og grave alle fire kanter på mesh buret i bakken for å sikre at biene ikke kan unnslippe. Lager av merdene med, blomstrende potteplanter som er kjent for å være attraktive for bier (f.eks bokhvete, borage, alyssum, Kosmos og solsikker) ( figur 2). Supplement merde…

Representative Results

Feltet bur studien: Data fra buret eksperimenter viste at bumble bee kolonier hadde en betydelig respons til soppdreper eksponering. Den soppdreper-behandlet elveblest produsert betydelig færre arbeidere (12.2 ± 3.8, gjennomsnittlig ± SE) enn kontroll strukturer (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (Figur 4). I tillegg var bee biomasse soppdreper-behandlet hives …

Discussion

Undersøkelser på virkningene av soppmidler på bee helse har forblitt et lite studert aspekt av pest management strategier. Vår studie som mål å bygge bro kunnskap ved hjelp av en rekke supplerende teknikker som eksplisitt isolerer potensielle faktorene kjøre bee avtar. Planlegging, begrunnelsen, og gjengivelse av disse eksperimentene er beskrevet nedenfor.

Det er viktig å sikre at ingen bier er tillatt å unnslippe mesh bur eksperimenter, siden dette ville kompromiss demografi analyse….

Materials

Natupol Beehive	Koppert	USRESM1	16 hives
Propiconazole 14.3	Quali-Ppro	60207-90-1	Propiconazole 14.3%
Abound	Syngenta	4033540	Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil	Syngenta	3452	Fungicide used for trials
Pollen granules	Bee rescued	B004D5650C	3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation	Currie Lab
Yeast strains for inoculation	Hittinger lab
Primer pairs	UW Biotech Center
DNA Isolation Kit	Mo Bio	12830-50	Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX	Thermo Fisher	4472952	Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855196	Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,	Axygen	10159-696	Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit	Agilent	5067-1504	Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer	Illumina		Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)	VWR