L'Assemblea e l'applicazione di "Shear Anelli ': A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Deviazioni da livelli normali e modelli di fluidi vascolari gioco di taglio ruolo importante nella fisiologia vascolare e fisiopatologia inducendo adattivo così come i cambiamenti patologici nel fenotipo endoteliale e l'espressione genica. In particolare, gli effetti disadattivi di periodico, flusso unidirezionale shear stress indotto possono innescare una varietà di effetti sui diversi tipi di cellule vascolari, in particolare le cellule endoteliali. Mentre ormai cellule endoteliali da diverse origini anatomiche sono state coltivate e approfondita analisi delle loro risposte al taglio fluido sono stati ostacolati dalla relativa complessità dei modelli di taglio (ad esempio, camera di flusso piatto parallelo, cono e modello di flusso piatto). Anche se questi rappresentano tutti ottimi approcci, tali modelli sono tecnicamente complessi e soffrono di svantaggi, tra cui i tempi di configurazione relativamente lungo e complesso, superfici basse, i requisiti per pompe e pressurizzazione spesso necessitano di sigillanti e guarnizioni, creando sfide per Both mantenimento di sterilità e l'incapacità di eseguire più esperimenti. Tuttavia, se più elevati di throughput modelli di flusso e taglio erano disponibili, maggiori progressi sulle risposte di taglio endoteliali vascolari, la ricerca di taglio particolare periodico a livello molecolare, potrebbe essere più rapida avanzata. Qui, descriviamo la costruzione e l'uso di anelli di taglio: un romanzo, semplice da montare, e poco costoso modello di coltura tissutale con un relativamente grande superficie che permette facilmente di un elevato numero di repliche sperimentali in unidirezionali, taglio periodico studi di stress su cellule endoteliali.
Introduction
Fluid shear stress ha dimostrato di modulare i programmi genetici endoteliali 1-5 mediante l'attivazione di elementi cis-normativo 6, istone acetiltransferasi attività 7 e gli elementi di risposta allo stress di taglio (SSRE) 8. Sforzo di taglio influenze contributi endoteliali verso la coagulazione modulando fattore tissutale 9 e attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) 10 espressione. Shear stress influenza anche il controllo dell'angiogenesi 11 e il rimodellamento nave regolando la sintesi PDGF-B e la reattività 8. Il endoteliale derivate mediatori vasoattivi adrenomedullin, endotelina-1, urotensina II e relaxina sono disciplinate anche da taglio 12. Trascrizione di produzione di ossido nitrico sintasi endoteliale e la produzione di ossido nitrico sono entrambi di taglio dipendono 10. Shear controlla anche endoteliale ICAM-1 13. shear stress indotto dal flusso può quindi powerfully influenzare una grande varietà di risposte endoteliali. È importante sottolineare che, pulsazioni vascolari ora appaiono anche a svolgere ruoli importanti nella fisiopatologia di entrambi invecchiamento vascolare normale e forme di demenza vascolare 14 e può anche contribuire ad altre malattie neurodegenerative, come la sclerosi multipla 15.
Tibiali e cellule endoteliali delle arterie sono intrinsecamente esposti a diversi modelli di flusso emodinamici in vivo, e molti fenotipi di cellule endoteliali diversi possono essere esposti 16. A seconda della grandezza e la periodicità di flusso, gli effetti sulle cellule endoteliali possono includere l'attivazione delle cellule infiammatorie e l'apoptosi, che possono riflettere i cambiamenti nei geni o proteine espressione 17,18. Studi sulla risposte delle cellule endoteliali a tranciare fenomeni pertanto restano complicate dalle difficoltà nella produzione di modelli in vitro che producono in modo adeguato tali modelli di taglio.
Molti experime diversoprotocolli ntale sono stati sviluppati per applicare fluido shear stress endoteliale monostrati di cellule. Uno dei sistemi più utilizzati è la camera di flusso a piatti paralleli, che crea flusso laminare uniforme all'interno della camera 19 – 21. Una pompa peristaltica è tipicamente collegato per creare flusso periodico, che può ricapitolare caratteristiche di flusso tipiche di molti luoghi in vivo 22. Un'altra comune set-up utilizza il modello 'cono e piatto', dove il fluido sollecitazione di taglio viene determinata dalla velocità di rotazione del cono 23. Entrambi i sistemi, e altre intese simili a loro, può essere noioso per impostare e richiedono componenti che possono essere relativamente costosi e inaccessibili a molti laboratori.
Un'altra importante limitazione di questi modelli attuali è il numero relativamente basso di studi ripetute che possono essere eseguite contemporaneamente, ciascuno con un'area superficiale relativamente bassa. Questo aumenta il tempo e co mplexity di tali approcci. Pertanto, un modello ideale che induce shear unidirezionale e periodica potrebbe essere quella in cui un elevato numero di repliche di studio può essere facilmente impostato, ciascuno con una relativamente grande superficie. Inoltre, i modelli di cui sopra richiedono una messa a punto abbastanza sofisticato, che può essere un costo proibitivo per molti utenti. Un modello che può produrre disturbi di taglio dei fluidi utilizzando materiali di laboratorio di base potrebbe avere diversi vantaggi.
Un metodo semplice e altamente economico dell'applicazione unidirezionale, giornali sollecitazione di taglio comporta il posizionamento dei piatti circolari in un agitatore orbitale 24. Questo protocollo è molto semplice e può essere scalata fino a raggiungere elevati numeri di studio replicano, ciascuno con una relativamente grande superficie, come necessario. Tuttavia, le cellule situato nel centro del piatto sono esposti a diversi schemi di flusso di celle lungo la periferia, cedendo misti risposte fenotipiche cellulari nello stesso piatto.
_content "> In questo rapporto attuale, si descrive la costruzione e l'utilizzo di 'anelli di taglio', il nostro modello per la creazione di unidirezionale e periodica sforzo di taglio. Il progetto per l'anello di taglio in modo efficace" misti "fenotipi di taglio indotta cellulari limiti limitando il flusso percorso all'interno di un piatto di coltura circolare alla periferia attraverso il posizionamento di un anello interno. la costruzione e il funzionamento dell'anello di taglio è semplice ed economico e può essere facilmente scalabile per soddisfare una vasta gamma di agitatori orbitali utilizzando ampiamente disponibili forniture di coltura tissutale. Questo modello può essere applicato in esperimenti di cellule endoteliali di fornire modelli di flusso unidirezionali e periodici ai livelli fisiologici e patofisiologici.Protocol
Representative Results
Discussion
La costruzione del sistema ad anello di taglio per esporre le cellule endoteliali al taglio è un approccio semplice per eseguire studi shear stress. Tuttavia, ci sono alcuni punti che sono fondamentali per l'ottenimento di anelli di taglio superiore e risultati migliori. Un sigillo completo dovrebbe essere fatta tra l'anello interno ed esterno per evitare che i supporti da perdite che potrebbe creare incoerente sforzo di taglio tra i campioni. Se una tenuta completa non è fatto, una quantità minima di cloruro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere l'aiuto di Mr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter e la Shreveport Jumpstart, SMART, e programmi di formazione Biostart così come il reparto Centenario College of Louisiana di Biofisica, Shreveport, LA.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
Riferimenti
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