L'Assemblea e l'applicazione di "Shear Anelli ': A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

Summary

Diversi livelli e modelli di taglio del fluido sono noti per modulare l'espressione genica endoteliale, il fenotipo e la suscettibilità alle malattie. Discutiamo l'assemblaggio e l'uso degli "anelli di taglio": un modello che produce modelli di sollecitazione di taglio unidirezionali e periodici. Gli anelli di taglio sono semplici da assemblare, economici e possono produrre elevate rese delle celle.

Abstract

Deviazioni da livelli normali e modelli di fluidi vascolari gioco di taglio ruolo importante nella fisiologia vascolare e fisiopatologia inducendo adattivo così come i cambiamenti patologici nel fenotipo endoteliale e l'espressione genica. In particolare, gli effetti disadattivi di periodico, flusso unidirezionale shear stress indotto possono innescare una varietà di effetti sui diversi tipi di cellule vascolari, in particolare le cellule endoteliali. Mentre ormai cellule endoteliali da diverse origini anatomiche sono state coltivate e approfondita analisi delle loro risposte al taglio fluido sono stati ostacolati dalla relativa complessità dei modelli di taglio (ad esempio, camera di flusso piatto parallelo, cono e modello di flusso piatto). Anche se questi rappresentano tutti ottimi approcci, tali modelli sono tecnicamente complessi e soffrono di svantaggi, tra cui i tempi di configurazione relativamente lungo e complesso, superfici basse, i requisiti per pompe e pressurizzazione spesso necessitano di sigillanti e guarnizioni, creando sfide per Both mantenimento di sterilità e l'incapacità di eseguire più esperimenti. Tuttavia, se più elevati di throughput modelli di flusso e taglio erano disponibili, maggiori progressi sulle risposte di taglio endoteliali vascolari, la ricerca di taglio particolare periodico a livello molecolare, potrebbe essere più rapida avanzata. Qui, descriviamo la costruzione e l'uso di anelli di taglio: un romanzo, semplice da montare, e poco costoso modello di coltura tissutale con un relativamente grande superficie che permette facilmente di un elevato numero di repliche sperimentali in unidirezionali, taglio periodico studi di stress su cellule endoteliali.

Introduction

Fluid shear stress ha dimostrato di modulare i programmi genetici endoteliali ^1-5 mediante l'attivazione di elementi cis-normativo ^6, istone acetiltransferasi attività ⁷ e gli elementi di risposta allo stress di taglio (SSRE) ^8. Sforzo di taglio influenze contributi endoteliali verso la coagulazione modulando fattore tissutale ⁹ e attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) ¹⁰ espressione. Shear stress influenza anche il controllo dell'angiogenesi ¹¹ e il rimodellamento nave regolando la sintesi PDGF-B e la reattività ^8. Il endoteliale derivate mediat....

Protocol

1. Costruzione di 150 mm di diametro Shear anelli (Figura 1)

NOTA: anelli di taglio possono essere costruiti per creare molteplici dimensioni variando le dimensioni della parabola Petri esterne ed interne, con conseguente dispositivi con diverse superfici totali, rese cellulari e sviluppato gamme di forze di taglio. Questo rapporto descrive un piatto 150 millimetri combinato con un interno piatto 100 mm per una superficie totale 98 cm ² (Figura 2).

Results

Qui vi presentiamo i risultati rappresentativi sia hCMEC / D3 cellule endoteliali del cervello e della retina di ratto monostrati di cellule endoteliali microvascolari, coltivate in anelli di taglio.

Dopo aver lasciato monostrati di cellule endoteliali cerebrali hCMEC / D3 a crescere a confluenza in completa EBM, gli anelli di taglio sono stati posti su un agitatore orbitale per 72 ore. Usando l'equazione dal punto 3.5, il mas.......

Discussion

La costruzione del sistema ad anello di taglio per esporre le cellule endoteliali al taglio è un approccio semplice per eseguire studi shear stress. Tuttavia, ci sono alcuni punti che sono fondamentali per l'ottenimento di anelli di taglio superiore e risultati migliori. Un sigillo completo dovrebbe essere fatta tra l'anello interno ed esterno per evitare che i supporti da perdite che potrebbe creare incoerente sforzo di taglio tra i campioni. Se una tenuta completa non è fatto, una quantità minima di cloruro di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra per coltura tissutale in plastica 100 x 20 mm	Corning	430167	Le piastre devono essere in polistirene
150 x 25 mm Piastra per coltura tissutale in plastica	Corning	430599	Le piastre devono essere in polistirene
Piastra Petri in vetro da 150 mm	Fisher	3160150BO
Provette in plastica per coltura tissutale in polistirene da 15 ml	Falcon	352099
Cloruro di metilene	Sigma-Aldrich	D65100
sigillante in gomma siliconica	DAP	7079808641
etanolo	Decon	2701
Pipetta di trasferimento da 3 ml	Becton-Dickinson	357524
stampante carta
forbici
guanti
utensile rotante e set	Dremel	4000-6/50
testa di taglio per utensile rotante	Dremel	EZ476
testa di foratura
distillata agitatore orbitale	VWR	57018-754
incubatore
Cellule endoteliali microvascolari retiniche di ratto	Cell Biologics	RA-6065