Församlingen och tillämpning av "Shear ringen": A Novel Endothelial modell för Orbital, enkelriktad och periodisk vätskeflöde och Shear stress
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Avvikelser från normala nivåer och mönster av vaskulära vätske skjuvning spela viktiga roller i vaskulär fysiologi och patofysiologi genom att inducera adaptiva samt patologiska förändringar i endotel fenotyp och genuttryck. I synnerhet kan maladaptiv effekter av periodisk, enkelriktat flöde inducerad skjuvspänning utlösa en rad olika effekter på flera vaskulära celltyper, speciellt endotelceller. Även vid det här laget endotelceller från olika anatomiska ursprung har odlats, djupgående analyser av deras svar på fluidfriktions har hämmats av den relativa komplexiteten i skjuvning modeller (t.ex. parallell platta flödeskammare, kon och platta flödesmodell). Även om alla dessa är utmärkta metoder, sådana modeller är tekniskt komplicerat och lider av nackdelar inklusive relativt långa och komplexa ställtid, ytor låga, krav för pumpar och tryck ofta kräver tätningsmedel och packningar, skapar utmaningar för both underhåll av sterilitet och en oförmåga att köra flera experiment. Men om högre genomströmning modeller av flöde och skjuvning fanns tillgängliga, större framsteg på vaskulära endotelceller skjuvning svar, särskilt återkommande forskning skjuvning på molekylär nivå, kan vara snabbare avancerade. Här beskriver vi konstruktionen och användningen av skjuvning ringar: en ny, enkel att montera och billig vävnadskultur modell med en relativt stor yta som lätt tillåter ett stort antal experimentella replikat i enkelriktade, periodiska skjuvspänning studier endotelceller.
Introduction
Fluid skjuvspänningen har visats modulera endoteliala genprogram 1 – 5 genom aktivering av cis-reglerande element 6, histonacetyltransferas-aktivitet 7 och skjuvspänning responselement (SSRE) 8. Skjuvspänning influenser endoteliala bidrag till koagulation genom att modulera vävnadsfaktor 9 och vävnadsplasminogenaktivator (tPA) 10 uttryck. Skjuvspänning påverkar också kontroll av angiogenes 11 och kärlet remodellering genom kontroll av PDGF-B-syntes och mottaglighet 8. Endothelial härledda vasoaktiva mediatorer adrenomedullin, endotelin-1, urotensin II och relaxin är också regleras av skjuvning 12. Transkription av endotelceller kväveoxid syntas produktion och produktionen av kväveoxid är både skjuvning beroende 10. Shear styr också endothelial ICAM-1 uttryck 13. Strömningsinducerad skjuvspänning kan därför kraftfully påverka en stor variation av endoteliala responser. Viktigt, vaskulära pulsationer nu också tycks spela en viktig roll i patofysiologin för både normal kärl åldrande och former av vaskulär demens 14 och kan även bidra till andra neurodegenerativa sjukdomar, såsom multipel skleros 15.
Venösa och arteriella endotelceller i sig utsatt för olika hemodynamiska flödesmönster in vivo, och många olika endotelcell fenotyper kan uppvisas 16. Beroende på storlek och periodicitet flöde, kan effekterna på endotelceller innefattar inflammatorisk cellaktivering och apoptos, vilket kan återspegla förändringar i genen eller proteinuttryck 17,18. Studier på endotelceller cellsvar att klippa fenomen därför fortfarande kompliceras av svårigheterna i att producera in vitro-modeller som på ett adekvat producerar sådana skjuvning mönster.
Många olika experimespecialist- protokoll har utvecklats för att applicera fluidum skjuvspänning till endoteliala cellmonoskikt. En av de mest använda systemen är den parallella plattflödeskammaren, vilket skapar en enhetlig laminärt flöde inuti kammaren 19-21. En peristaltisk pump är typiskt ansluten till skapa återkommande flöde, som kan sammanfatta flödesegenskaper som normalt återfinns på många ställen in vivo 22. En annan vanlig uppställning använder "kon och platta" modell, där vätska skjuvspänning bestäms av rotationshastigheten hos könen 23. Båda systemen och andra arrangemang som liknar dem, kan vara tröttsamt att installera och kräver komponenter som kan vara relativt dyra och otillgängliga för många laboratorier.
En annan större begränsning av dessa nuvarande modeller är den relativt låga antalet replikat studier som samtidigt kan utföras, var och en med en relativt låg ytarea. Detta ökar den tid och co mplexity av sådana metoder. Därför kan en idealmodell som inducerar enkelriktad och återkommande skjuvning vara ett där ett stort antal studie replikat kan enkelt ställa in, var och en med en relativt stor yta. Vidare är de tidigare nämnda modeller kräver en ganska sofistikerad setup, vilket kan vara kostsamt för många användare. En modell som kan producera fluidfriktionsstörningar med hjälp av grundläggande laboratorie material kan ha flera fördelar.
En enkel och mycket ekonomisk metod för att applicera ensriktad, periodisk skjuvspänning innebär placering av cirkulära rätter på en orbital skakanordning 24. Detta protokoll är mycket enkel och kan skalas upp för att uppnå ett stort antal av studien replikerar, var och en med en relativt stor ytarea, som behövs. Emellertid är cellerna belägna i centrum av skålen utsätts för olika flödesmönster än celler utmed periferin, vilket gav blandade cellulära fenotypiska svar i samma skålen.
_content "> I den nuvarande rapporten beskriver vi konstruktionen och användningen av" skjuvning ringarnas, vår modell för att skapa enkelriktad och återkommande skjuvspänning. Designen för skärringen begränsar effektivt "blandade" cellulära skjuvning-inducerad fenotyper genom att begränsa flödet väg inom en cirkulär odlingsskål till periferin genom placering av en inre ring. konstruktionen och driften av skärringen är enkel och billig och kan lätt skalas för att rymma ett brett spektrum av omloppsbanor shakers använder allmänt tillgängliga vävnadsodlingsmaterial. Detta modellen kan tillämpas i endoteliala cellförsök för att ge enkelriktade och återkommande flödesmönster inom fysiologiska och patofysiologiska nivåer.Protocol
Representative Results
Discussion
Konstruktionen av den skjuvning ringsystemet för att exponera endotelceller för skjuvning är en enkel metod för att utföra skjuvspänning studier. Det finns dock några steg som är kritiska för att erhålla överlägsna skjuvning ringar och bättre resultat. En fullständig tätning bör göras mellan den inre och yttre ringen för att förhindra media från läckage som skulle kunna skapa inkonsekvent skjuvspänning bland prover. Om en fullständig tätning inte görs, bör en minimal mängd metylenklorid tills?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för den hjälp av Christopher Nguyen, Aaron Hunter och Shreveport Jumpstart SMART, och Biostart utbildningsprogram samt Centenary College of Louisiana Department of biofysik, Shreveport, LA.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
Riferimenti
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
