Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Sommario

Descriviamo un test basato sulla fluorescenza per misurare lo scrambling dei fosfolipidi in grandi liposomi unilamellari ricostituiti con opsina.

Abstract

Scramblases traslocano fosfolipidi attraverso il doppio strato di membrana bidirezionale in modo ATP-indipendente. Il primo scramblase per essere identificati e biochimicamente verificato è stato opsin, la apoprotein della rodopsina fotorecettori. Rhodopsin è un recettore accoppiato alla proteina G localizzato in rod fotorecettori membrane a disco della retina dove è responsabile per la percezione della luce. Attività scramblase di Rhodopsin non dipende dal suo ligando 11- cis -retinal, cioè, il opsin apoprotein è anche attivo come scramblase. Sebbene fosfolipidi costitutiva e regolato scrambling svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare, solo pochi scramblases fosfolipidi sono stati identificati finora oltre opsin. Qui si descrive un saggio di fluorescenza a base di attività di scramblase opsin. Opsina viene ricostituito in grandi liposomi unilamellari composti di fosfatidilcolina, phosphatidylglycerol e una quantità traccia di fluorescenza NBD marcato PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-il) ammino] esanoile} - sn -glycero-3-phosphocholine). attività Scramblase è determinata misurando la misura in cui le molecole NBD-PC situati nel foglietto interno della vescicola sono in grado di accedere al foglietto esterno dove la loro fluorescenza viene eliminata chimicamente da un agente riducente che non può attraversare la membrana. I metodi che descriviamo hanno applicabilità generale e può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le attività scramblase di altre proteine ​​di membrana.

Introduzione

La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento ^1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato ^2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti ^4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l'omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glico....

Protocollo

1. Preparazione di liposomi e proteoliposomi

1. Formazione liposomi
   1. Usando una siringa di vetro, aggiungere 1.435 microlitri POPC (25 mg / ml, in cloroformio) e 160 microlitri POPG (25 mg / ml, in cloroformio) in un pallone a fondo rotondo da ottenere 52,5 mmol lipidi in un rapporto molare di POPC: POPG = 9: 1.
   2. Essiccare i lipidi per 30 minuti usando un evaporatore rotante ad una velocità di rotazione di 145 rpm (senza bagno d'acqua è necessaria per questo volume di solvente), quindi trasferire il pallone in un essiccatore sotto vuoto per almeno 3 ore, o durante la notte, a temperatura ambiente (RT).
   3. Idratare il film lipidico ....

Risultati

Descriviamo la ricostituzione di opsin in luvs per caratterizzare la propria attività scramblase usando un test basato sulla fluorescenza. Analizziamo i risultati di porre un limite inferiore del tasso di fosfolipidi opsin mediata scomposizione e per determinare lo stato oligomerico in cui opsin ricostituisce funzionalmente nelle vescicole.

Per identificare le condizioni ottimali di ricostituzione, è necessario determinare emp.......

Discussione

Il saggio di attività scramblase ci ha permesso inizialmente di determinare che opsin ha fosfolipidi attività scramblase ^2. Il test ha anche permesso di caratterizzare l'attività scramblase di opsin testando specificità (abbiamo usato una varietà di lipidi giornalista NBD-etichettati come NBD-fosfatidiletanolamina, marcato con NBD su una catena acilica come mostrato ad NBD-PC in Figura 1A, o headgroup, NBD-sfingomielina o NBD- fosfatidilserina ^2), l'effetto di vescicole com.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoil-2-oleyl-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerolo) (sale sodico	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoil-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzossadiazol-4-il)ammino]esanoil}-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico	acido VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl Sigma		S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimetro cuvette	sigma	C0918-100EA	cuvette
Spettrofluorimetro	Photon Technology International, Inc.	fluorimetro
Idrosolfito di sodio grado tecnico, 85%	Sigma	157953-5G	ditionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml estrusore	Lipidi settentrionali, Inc.		Estrusore
Whatman, Disco di drenaggio, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Supporto disco
Whatman Nuclepore Track-Etched membrane, 0,4 & micro; m, diametro 25 mm	Sigma	WHA110607	membrana 400 nm
Membrane Whatman Nucleopore Track-Etched, 0,2 & micro; m, diametro 25 mm	Sigma	WHA110606	membrana 200 nm
fosfato di sodio	Sigma	S3264-500G
Provette per colture VWR, monouso, vetro borosilicato, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	provette in vetro
Acido perclorico	Sigma	30755-500ML
Molibdato di ammonio Tetraidrato	Sigma	A-7302	Molibdato di ammonio
(+)-L-ascorbato di sodio	Sigma	A7631-25G	ascorbato di sodio
Bio-Beads SM2 adsorbenti	Bio Rad	1523920	perle di polistirene
Microprovette da 2,0 ml trasparenti	VWR Scientific	10011-742	Provette
ricostituzione Tubo in vetro per ricostituzione	VWR Scientific	53283-800	Provette per ricostituzione
in vetro Zetasizer	Malvern		Dls

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