Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Summary

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

Abstract

interacções proteína-proteína desempenham um papel fundamental na função de um organismo vivo. Uma vez que uma interacção tem sido identificadas e validadas, é necessário caracterizar-la ao nível estrutural e mecânica. Existem vários métodos bioquímicas e biofísicas para tal finalidade. Entre eles, Anisotropia de fluorescência é uma técnica poderosa particularmente utilizado quando a intensidade de fluorescência de uma proteína marcada com fluoróforo permanece constante após a interacção proteína-proteína. Nesta técnica, uma proteína marcado com fluoróforo é animado com luz polarizada verticalmente de um comprimento de onda apropriado que excita selectivamente um subconjunto dos fluoróforos de acordo com a sua orientação em relação com o feixe de entrada. A emissão resultante também tem uma direcionalidade cujo relacionamento nos planos vertical e horizontal define anisotropia (r) como segue: r = (I _VV -I _VH) / (I _VV + 2I _VH), onde eu _VV e eu <sUB> VH são as intensidades de fluorescência das componentes verticais e horizontais, respectivamente. Anisotropia de fluorescência é sensível à difusão de rotação de um fluoróforo, ou seja, o tamanho molecular aparente de um fluoróforo ligado a uma proteína, que é alterado por interacção proteína-proteína. No presente texto, a utilização da anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interacções proteína-proteína foi exemplificado para tratar a ligação entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como-1 GTPase (EFL1). Convencionalmente, a etiquetagem de uma proteína com um fluoróforo é realizada sobre os grupos tiol (cistea) ou nos grupos amino (a amina N-terminal ou da lisina) da proteína. No entanto, SBDS possui várias cisteínas e lisinas que não permitiam site de rotulagem dirigido dele. Como uma técnica alternativa, o corante de 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína foi utilizado para marcar especificamente um motivo tetraciste�a, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, geneticamente modificada no terminal C da proteína recombinante SBDS. Montagem dos dados experimentais fornecida informação quantitativa e mecanística sobre o modo de ligação entre estas proteínas.

Introduction

As células contêm um grande número de biomacromoléculas constantemente que interagem uns com os outros. Esta associação dá origem a complexos que participam nas vias celulares responsáveis ​​para o seu funcionamento na transdução de sinal, a regulação da expressão do gene e a migração de células, entre outros. Todas as interacções proteína-proteína que ocorrem numa célula compreendem uma rede conhecida como a interactoma. Em Saccharomyces cerevisiae foram mostrados mais do que 70% das suas proteínas de ter parceiros interactuantes ^1. Compreender o interactome de uma célula e suas funções fornecem informações relevantes sobre a complexidade e diversidade dos organismos vivos. Várias metodologias têm sido descritos para identificar e caracterizar as interacções proteína-proteína. Diferente alta através de métodos colocados como a levedura de dois híbridos ^2, ensaios de complementação de proteína-fragmento de ^{3, 4} purificação por afinidade acoplada a espectrometria de massa e microarra proteínays são utilizados para identificar uma interacção ^5,6. Uma vez identificado, é necessário para a sua validação e pode variar numa base de caso-a-caso. Tipicamente, estas experiências envolvem interromper a interacção si ao nível dos membros individuais do par de interacção, por exemplo, por deleção do gene ou a superexpressão de uma das proteínas, e, em seguida, à procura de mudanças nas propriedades ou a função do outro membro do nível celular. Subsequentemente, as técnicas biofísicas ⁷ são usados para caracterizar a interacção proteína-proteína, a nível molecular. Para este fim, a estrutura dos complexos de proteína são determinadas por cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear e microscopia crio-electrões enquanto calorimetria e espectroscopia de fluorescência são usadas para quantitativamente e mecanisticamente os descrever.

Neste trabalho, Anisotropia de fluorescência foi usada como uma técnica para caracterizar a interacção entre a GTPase EFL1 e SBDproteína S. Estas proteínas participam na síntese de ribossomas, promovendo a libertação do factor de iniciação eucariótico 6 a partir da superfície das subunidade ribossomal 60S ^8. A proteína SBDS está mutado em uma doença conhecida como síndrome de Shwachman- diamante ⁹ e actua como um factor de troca do nucleótido guanina para EFL1 diminuindo a sua afinidade para o difosfato de guanosina ^10,11. mutações doença em SBDS abolir a interação com EFL1 e, assim, evitar a sua activação.

Anisotropia de fluorescência é comumente utilizado em aplicações biológicas para estudar proteína-péptido ou interacções proteína-ácido nucleico. Baseia-se no princípio de que um fluoróforo excitado com resultados de luz polarizada em uma emissão parcialmente polarizado. anisotropia de fluorescência é definido pela Equação 1:

onde _VV e _VH são osintensidades de fluorescência da vertical _(VV) e horizontal _(VH) polarizado emissão quando a amostra está animado com verticalmente luz polarizada ^12. Anisotropia de fluorescência é sensível a factores que afectam a taxa de difusão de rotação do fluororo e, portanto, depende da temperatura, da viscosidade da solução e o tamanho molecular aparente do fluoróforo. O tamanho aparente de uma proteína que contém um fluoróforo aumenta quando ele interage com uma outra proteína e em seguida, tal mudança pode ser avaliada como uma alteração na anisotropia. Mais especificamente, um fluoróforo, que roda lentamente em solução em relação ao seu tempo de vida de fluorescência terá um grande valor I _VV e o valor pequeno I _VH e, por conseguinte, irá apresentar uma relativamente grande anisotropia. Para fluoróforos que caem rapidamente em relação ao seu tempo de vida de fluorescência, eu _VV e _VH I será semelhante eo seu valor de anisotropia será pequeno ¹² </sup> (Figura 1). Além disso, para um bom sinal de anisotropia para medição de ruído, é necessário ter um fluoróforo com um tempo de vida de fluorescência similar ao tempo de correlação rotacional da molécula de interesse. Caso contrário, não é possível registar com precisão a diferença de anisotropia entre a proteína livre e que, no complexo. Por exemplo, a anisotropia de uma sonda fluorescente, com um tempo de vida perto de 4 ns, tais como fluoresceína ou rodamina ligados a um composto de baixo peso molecular de 100 Da é 0,05. A ligação a uma molécula de 160 kDa vai aumentar o seu valor de anisotropia de 0,29; uma diferença que pode ser medido com precisão. Em contraste, a mesma sonda fluorescente envolvido numa reacção de ligação cuja aumento no tamanho molecular varia de 65 a 1000 kDa só vai resultar numa alteração de anisotropia de 0,28 a 0,3, o que é demasiado pequeno para ser medido com precisão. Neste cenário, uma sonda com uma vida útil de 400 nanossegundos seria mais adequado ^12.

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Figura 1. Representação esquemática do equipamento utilizado para medir a anisotropia de fluorescência e o procedimento. Representação esquemática do equipamento utilizado para realizar uma medição de fluorescência anisotropia experimento interacção proteína-proteína. Fluoróforos que caem rápido pequena anisotropia de exibição que aumenta após ligação a um parceiro de interação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

aplicações de fluorescência requerem a presença de um fluoróforo em qualquer uma das moléculas estudadas. Para estudar as interacções proteína-proteína, existem três tipos de fluoróforos: 1) os resíduos de triptofano presentes nas proteínas, 2) fluoróforos ligados quimicamente e 3) parceiros de fusão fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP) e a sua derivativas. A maioria das proteínas têm resíduos de triptofano na sua estrutura, portanto, a forma mais fácil de medir uma interacção é através da monitorização das alterações na espectros de fluorescência correspondente ou por monitorização das alterações na intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. No entanto, os resíduos de triptofano podem estar presentes em ambas as proteínas que complicam a análise. Por outro lado, para um fluoróforo para alterar as suas propriedades fluorescentes, devido a uma interacção precisa de ser localizado em ou perto do local de ligação e que poderia interferir com a própria interacção. Este precisa de atenção especial quando se utiliza fluoróforos volumosos, como GFP. Se nenhum destes fluoróforos podem ser utilizados para estudos de ligação é necessário, em seguida, introduzir fluoróforos extrínsecos ao uma das proteínas envolvidas. Existem muitos fluoróforos quimicamente sintetizados e podem ser ligados covalentemente a proteínas através dos seus grupos reactivos tais como os grupos amina da cadeia lateral (de lisinas ou no terminal N) e os grupos tiol na cisteína. Fderivados luorophore com ésteres de succinimidilo e isotiocianato de reagir com grupos de amida, enquanto a iodoacetamida e maleimida são grupos ^13-tiol reactivos. Os corantes mais comuns usados ​​em aplicações de fluorescência são derivados da fluoresceína e rodamina os corantes verdes, cumarinas, e corantes BODIPY fluoróforos Alexa Fluor. Uma lista detalhada de fluoróforos disponíveis comercialmente e a sua utilização pode ser encontrada em referências ^14,15. Para a marcação com êxito, o grupo reactivo deve ser expostos na superfície da proteína, mas, devido ao grande número de grupos funcionais reactivos, tipicamente presentes em polipéptidos, é muito difícil conseguir a modificação específica do local. A proteína de interesse neste estudo, SBDS, contém 5 cisteínas livres e 33 lisinas que podem resultar na marcação de vários sites. rotulagem não uniforme pode afectar a ligação e vai complicar a análise de dados como moléculas fluoróforo diferentes podem provocar diferentes sinais de intensidade de fluorescência após a ligação. para overcome esse problema, foi utilizado o fluoróforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína com o selo de site direto da proteína SBDS. Este é um corante arsenoxide com uma elevada afinidade para quatro cisteínas espaçadas num motivo conhecido como FLASH-tag que consiste na sequência de CCXXCC onde X é qualquer aminoácido excepto cisteína ^16,17. Este motivo tetraciste�a é adicionado à extremidade N ou C-terminal da proteína através da engenharia genética juntamente com um ligante apropriado para evitar o rompimento da dobragem global da proteína. O par constituído por corante flash e-tag foi originalmente concebido para proteínas de etiquetas específicas do local em células ¹⁷ que vivem, mas também pode ser usado para rotular proteínas purificadas in vitro, como é exemplificado aqui. Além disso, as estratégias enzimáticas também têm sido desenvolvidos para permitir a funcionalização do local específico de proteínas ^18.

Nesse artigo, procuramos descrever a utilidade da fluorescência anisotropia umferramenta sa para estudar as interações proteína-proteína. A ligação pode ser avaliada através de uma simples inspecção da forma da curva de ligação enquanto que a informação quantitativa pode ser obtida a partir do ajuste dos dados experimentais.

Protocol

1. SBDS-flash Expressão Tag e purificação de proteínas NOTA: Para as experiências de anisotropia, uma FLASH-tag que corresponde à sequência Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys foram adicionados ao C-terminal da sequência de codificação SBDS humanos por PCR. Esta construção foi subclonado no vector de expressão pRSET-A e transformada em células C41 de Escherichia coli para expressar uma proteína que codifica uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal (His-tag), as SBDS humanos e uma sequência C-terminal…

Representative Results

Para realizar qualquer experiência anisotropia é importante para descartar grandes mudanças na intensidade de fluorescência do fluoróforo uma vez que a anisotropia observada de uma mistura de espécies é representado pela Equação 5: onde F i representa a fluorescência fracc…

Discussion

A maioria das experiências bioquímicas com proteínas requerem não só proteína pura, mas também uma grande quantidade deles, independentemente da técnica utilizada. Por esta razão, as proteínas utilizadas para este tipo de experiências são obtidos por expressão heteróloga, como era o caso aqui apresentado. espectroscopia de fluorescência requer a presença de um fluoróforo na molécula estudada. resíduos aromáticos constituem os fluoróforos intrínsecas de uma proteína, no entanto, utilizando o seu si…

Materials

0.5 mm Glass beads	Biospec Products	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Ultra pure
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein	ThermoFischer Scientific	LC6090	This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous	Formedium	GLU03
D(+)-Galactose	Formedium	GAL03
L-Leucine	Formedium	DOC0157
L-Tryptofan	Formedium	DOC0189
Bezamidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl	Formedium	NAC02	Sodium Chloride
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Magnesium Chloride
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0410
Yeast extract	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Filtration units	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column	QIAGEN	30760	Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell	Hellma Analytics	111-057-40
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Shaker	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer	Olis	No applicable	Olis DM 45 with Polarization Toolbox