Visualiser les premiers stades de la phagocytose
Summary
Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.
Abstract
Le corps d'un mammifère est équipé de diverses couches de mécanismes qui aident à se défendre contre les invasions de pathogènes. Phagocytes professionnels du système immunitaire – telles que les neutrophiles, les cellules dendritiques et les macrophages – conservent la capacité innée à détecter et à éliminer les pathogènes envahissants par phagocytose 1. Phagocytose implique des événements chorégraphiés de réorganisation de la membrane et l' actine remodelage à la surface des cellules 2, 3. Phagocytes internaliser avec succès et éliminer les molécules étrangères que lorsque toutes les étapes de la phagocytose sont remplies. Ces étapes comprennent la reconnaissance et la liaison de l'agent pathogène par les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) demeurant à la surface cellulaire, la formation de la coupe phagocytaire par actine enrichi protubérances membranaires (de pseudopodes) pour entourer les particules, et la scission du phagosome suivie par phagolysosome maturation qui les résultats dans letuant de l'agent pathogène 3, 4.
L'imagerie et la quantification des différentes étapes de la phagocytose joue un rôle déterminant pour l'élucidation des mécanismes moléculaires de ce processus cellulaire. Le présent manuscrit rapporte des méthodes pour étudier les différentes phases de la phagocytose. Nous décrivons une approche basée sur un microscope à visualiser et de quantifier la liaison, la formation de tasse phagocytaire, et l'internalisation des particules par les phagocytes. Phagocytose se produit lorsque les récepteurs des cellules phagocytaires innées rencontrent des ligands sur une particule cible supérieure à 0,5 um, les essais présentés ici comprennent l'utilisation de champignons pathogènes de Candida albicans et d' autres particules telles que des billes zymosan et recouvertes d' IgG.
Introduction
En dépit de l'exposition continue à des agents pathogènes tels que les bactéries, les virus et les champignons, notre corps est bien équipé avec un mécanisme immunitaire qui offrent une protection contre l'infection. Le système immunitaire inné est la première ligne de défense contre les agents pathogènes envahisseurs et repose principalement sur les cellules phagocytaires qui reconnaissent et internalisent des cibles étrangères.
La phagocytose est un processus cellulaire évolutivement conservée qui englobe l'engloutissement de particules indésirables supérieures à 0,5 um. Les cellules phagocytaires expriment un large éventail de récepteurs immunitaires (également appelés récepteurs de reconnaissance des formes, PRR) à la surface des cellules qui leur permettent de reconnaître des modèles moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) présents sur les agents pathogènes avant engloutissement 3. La liaison pathogène est suivie par le regroupement des récepteurs à la surface des cellules et provoque la formation d'une coupelle phagocytaire. Cela se traduit par le remodelage de la membrane entraînée actine qui fait saillie versla cible, éventuellement enveloppant et pincer-off pour former un phagosome discret vacuole 2, 5. Phagosome et mûrit ensuite acidifie par fusion ultérieure avec les endosomes tardifs et les lysosomes qui forme phagolysosome 6.
Bien que la phagocytose est décrite comme événement médié par le récepteur et entraîné actine, ce procédé repose également sur la modification spatio-temporelle des lipides composant la membrane plasmique, tels que les phosphoinositides (PI) et de sphingolipides 7, 8. Alors que la polymérisation de l' actine est dictée par une accumulation locale de phosphoinositol-4,5-bisphosphate (PI (4,5) P2) à la base de la coupelle de phagocytose, l' actine dépolymérisation dépend de la conversion de (PI (4,5) P 2 à phospho-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Les deux modificationssont essentiels comme les anciens conduit à l' extension réussie de pseudopodes autour de la cible et celle – ci permet d' amortissement de particules dans le cytosol du phagocyte 10.
Les cellules qui ont la capacité de phagocytose sont soit des phagocytes professionnels, comme les macrophages / monocytes, les granulocytes neutrophiles et / cellules dendritiques (CD) ou les phagocytes non professionnels, tels que les fibroblastes et les cellules epitheliales 11. Phagocytose effectué par tous les phagocytes joue un rôle central dans l'entretien des tissus et le remodelage, tandis que la phagocytose effectuée par phagocytes professionnels est responsable de la coordination de la réponse immunitaire innée et adaptative contre les pathogènes. phagocytes professionnels ne phagocytent pas seulement et tuer l'agent pathogène, mais aussi des antigènes présents sur les cellules lymphoïdes du système immunitaire adaptatif. Cela contribue à la libération de cytokines pro-inflammatoires et à l'engagement des cellules lymphoïdes, conduisant donc àle blocus succès de l' infection 12.
techniques biochimiques classiques ont contribué à l'acquisition de connaissances en ce qui concerne le mécanisme moléculaire de différents processus cellulaires au cours de la phagocytose, telles que des modifications post-traductionnelles et diverses associations de haute affinité entre les protéines. Cependant, il est difficile d'obtenir des informations sur la dynamique spatiale et temporelle des événements phagocytaires en utilisant les méthodes biochimiques classiques. imagerie cellulaire en direct non seulement nous permet de suivre les événements cellulaires d'une manière sensible à la fois, mais aussi nous permet d'obtenir de l'information au niveau de la cellule unique. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier les différents stades de la phagocytose, ainsi que d'analyser l'ensemble du processus spatio-temporelle en utilisant la microscopie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
phagocytes professionnels, tels que les macrophages et les cellules dendritiques, engloutir et d'éliminer les pathogènes envahisseurs rendant ainsi la phagocytose une composante importante du système de défense de l'hôte. Au cours de ce processus phagocytes subissent une réorganisation de la membrane et le réarrangement du cytosquelette à leur surface cellulaire 8, 19, 20. Pour mieux comprendre ce processus dyna…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Wendy Salmon et Nicki Watson de l'installation Keck à l'Institut Whitehead du MIT pour l'imagerie.
Materials
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200mM (100X) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10'000U/mL) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1X) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
Riferimenti
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