Visualisera de tidiga stadierna av Fagocytos
Summary
Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.
Abstract
Däggdjurskroppen är utrustad med olika lager av mekanismer som bidrar till att försvara sig mot patogena invasioner. Professionella fagocyter i immunsystemet – såsom neutrofiler, dendritiska celler och makrofager – behålla den inneboende förmåga att upptäcka och rensa sådana invaderande patogener genom fagocytos en. Fagocytos involverar koreografe händelser av membran omorganisation och aktin remodellering vid cellytan 2, 3. Fagocyter framgångsrikt internalisera och utrota främmande molekyler endast när alla stadier av fagocytos är uppfyllda. Dessa steg inkluderar igenkänning och bindning av patogenet genom mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs) bosatt på cellytan, för att bildningen av fagocytisk kopp genom aktin berikad membranösa utsprång (pseudopods) omger den partikelformiga, och uppdelning av den phagosome följt av phagolysosome mognad som resulterar i attdödande av patogenen 3, 4.
Imaging och kvantifiering av olika stadier av fagocytos är avgörande för att belysa de molekylära mekanismerna för detta cellulär process. Den nuvarande manuskriptet rapporterar metoder för att studera de olika faserna av fagocytos. Vi beskriver ett mikroskop baserad metod för att visualisera och kvantifiera bindningen, fagocytisk kopp bildning och internalisering av partiklar av fagocyter. Som fagocytos uppstår när medfödda receptorer på fagocytiska celler möter ligander på ett mål partikel större än 0,5 um, analyserna vi presenterar här omfattar användning av patogena svampar Candida albicans och andra partiklar som zymosan och IgG-belagda pärlor.
Introduction
Trots kontinuerlig exponering för patogener, såsom bakterier, virus och svampar, är vår kropp väl utrustade med immunmekanism som ger skydd mot infektion. Det medfödda immunförsvaret är den första försvarslinjen mot invaderande patogener och förlitar sig huvudsakligen på fagocytiska celler som känner igen och internaliserar utländska mål.
Fagocytos är ett evolutionärt konserverat cellulär process som omfattar omvälvning av oönskade partiklar större än 0,5 pm. Fagocytiska celler uttrycker ett brett spektrum av immunreceptorer (även känd som mönsterigenkänningsreceptorer, PRRS) vid cellytan som gör det möjligt för dem att känna igen patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) förekommer på patogener före engulfment 3. Patogen bindning följs av receptorklusterbildning vid cellytan och utlöser bildandet av en fagocytisk kopp. Detta resulterar i aktin-driven membran ombyggnad som sticker ut runtmålet, slutligen omsluter den och nypa-off för att bilda en diskret phagosomal vacuole 2, 5. Den phagosome mognar sedan och försurar genom efterföljande fusion med sena endosomer och lysosomer som bildar phagolysosome 6.
Även fagocytos beskrivs som receptormedierad och aktin-driven händelse, denna process är också beroende av spatial-temporal modifiering av lipider som utgör plasmamembranet, såsom fosfoinositider (PI) och sfingolipider 7, 8. Medan aktin polymerisation dikteras av en lokal ansamling av fosfoinositol-4,5-bifosfat (PI (4,5) P2) vid basen av den fagocytiska cup, aktin depolymerisation beror på omvandlingen av (PI (4,5) P 2 att fosfoinositol-3,4,5-bifosfat (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Båda ändringarär viktigt eftersom de tidigare leder till framgångsrik utvidgning av pseudopods kring målet och senare möjliggör sjunka av partiklar i cytosolen av fagocyt 10.
Celler som har förmåga att fagocytera är antingen yrkesmässiga fagocyter, såsom makrofager / monocyter, granulocyter / neutrofiler, och dendritiska celler (DC) eller nonprofessional fagocyter, såsom fibroblast och epitelceller 11. Fagocytos som utförs av alla fagocyter spelar en central roll i vävnads underhåll och ombyggnad, medan fagocytos utförs av professionella fagocyter är ansvarig för samordningen av det medfödda och adaptiva immunsvar mot patogener. Professionella fagocyter inte bara uppsluka och döda patogenen, men innebär även antigener till de lymfoida celler av det adaptiva immunsystemet. Detta bidrar till frisättning av proinflammatoriska cytokiner och till ingrepp av lymfoidceller, vilket orsakarframgångsrik blockad av infektion 12.
Konventionella biokemiska tekniker har varit avgörande för att få kunskap om den molekylära mekanismen av olika cellulära processer under fagocytos, såsom posttranslationella modifieringar och olika hög affinitet samband mellan proteiner. Det är dock svårt att få information om den rumsliga och tidsmässiga dynamiken i fagocytiska händelser med hjälp av konventionella biokemiska metoder. Levande cell imaging inte bara tillåter oss att övervaka cellulära händelser i en tid känsligt sätt utan också ger oss möjlighet att få information på en enda cell nivå. Här beskriver vi en metod för att undersöka de olika stadierna av fagocytos, liksom att analysera hela processen spatiotemporally med hjälp av konfokalmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Professionella fagocyter, såsom makrofager och dendritiska celler, uppsluka och eliminera invaderande patogener därför gör fagocytos en viktig komponent i värdförsvarssystemet. Under denna process fagocyter genomgår omfattande membran omorganisation och cytoskelettet omlagring vid sin cellyta 8, 19, 20. För att bättre förstå denna dynamiska process, är väsentligt visualisering av de olika stadierna av fagocytos. H?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Wendy Lax och Nicki Watson i Keck anläggningen vid Whitehead Institute of MIT för avbildning.
Materials
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200mM (100X) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10'000U/mL) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1X) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
Riferimenti
- Janeway, C. A., Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis. BBA. 1851, 805-823 (2015).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton’s Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
