세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석
Summary
이 보고서는 특성화 세균성 외부 막 단백질 및 인간 보완 레 귤 레이 터 vitronectin 사이 상호 작용에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 바인딩 반응 어떤 세균성 종에 vitronectin의 생물 학적 기능을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.
Abstract
박테리아는 호스트 면역 반응을 회피의 수단으로 보완 레 귤 레이 터를 사용 합니다. 여기, 우리는 호스트 면역 시스템에 저항에 세균성 세포 표면 놀이에 역할 vitronectin 인수를 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 교류 cytometry 실험 Haemophilus 함께 유형 f의 세균성 수용 체 외부 막 단백질 H에 대 한 리간드로 인간의 플라즈마 vitronectin를 확인. 순화 된 재조합 단백질 H와 vitronectin, 간의 단백질-단백질 상호 작용 하는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 고용 되었다 하 고 바이오-레이어 간섭계를 사용 하 여 평가 했다 선호도 바인딩. 호스트 면역 반응의 회피에 세균성 세포 표면에 단백질 H vitronectin의 바인딩의 생물학 중요성 정상 및 vitronectin 고갈 인간의 혈 청 혈 청 저항 분석 결과 사용 하 여 확인 되었다. 세균성 부착에서 vitronectin의 중요성 vitronectin 코팅, 그램 얼룩 뒤 없이 유리 슬라이드를 사용 하 여 분석 했다. 마지막으로, 세균성 접착 인간 폐 포 상피 세포 monolayers 조사 했다. 여기에 설명 된 프로토콜 관심의 어떤 세균성 종의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
Vitronectin (Vn)는 중요 한 인간의 당단백질 fibrinolytic 시스템의 규제를 통해 항상성 유지에 관여 이다. Vn 또한 보완 레 귤 레이 터로 C5b6-7 복잡 한 형성과 C9 중 합 하는 동안 터미널 보충 통로 억제 함으로써 작용 한다. 여러 가지 세균성 병원 체 저항 보완 증 착1,2,3의 수단으로 세포 표면에 Vn을 모집 하기 위해 표시 되었습니다. 또한, Vn 박테리아 및 호스트 상피 세포 수용 체, 그로 인하여 추진 준수 및 병원 체2,,45의 국제화 사이 “샌드위치” 분자 기능을 합니다. 바인딩 Vn의 세균성 세포 표면에는 현재 정체 불명된 다른 단백질에 의해 중재 됩니다. Vn-에서 바인딩 회피 호스 면역 반응의 기능적인 역할을 완전히 elucidating 따라서 Vn 모집 단백질의 식별을 요구할 것 이다.
Vn-바인딩 단백질을 확인 하는 초기 단계는 관심의 병원 체는 순화 Vn. 교류 cytometry 바인딩할 수 있는지 여부를 테스트 Vn 병원 체 세포에 바인딩되어 있는지 여부를 확인 하는 편리 하 고 간단한 방법입니다. 이 연구에서 우리는 다양 한 Haemophilus 함께 유형 f (Hif) 임상 격리6Vn의 바인딩을 평가. 여기에 설명 된 방법은 양적 이며 다양 한 세균성 긴장의 바인딩 용량을 구분 하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 연구에서 우리는 Vn-바인딩 단백질7단백질 H (전화), Hif의 특징. 따라서, 현재 연구에서 야생-타입 (WT) Hif 및 Hif M10Δlph 돌연변이의 Vn 바인딩 잠재력 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 비교 했다.
병원 체 Vn 바인딩합니다 확인은, 두 번째 단계는 표면 프로테옴 잠재적인 Vn-바인딩 단백질 식별 특성. 다양 한 접근법이 목적8,9를 사용할 수 있습니다 그러나 이러한 방법론은이 보고서에서 설명 하지 않습니다. 단백질 단백질 상호 작용을 조사 하기 위한 가장 적합 한 방법은 recombinantly 대장균 에서 선택한 세균성 표면 단백질을 표현 하 고 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하입니다. 여기, 우리 사용 PH Vn와 분자의 상호 작용 방법을 설명 합니다. 재조합 PH와 Vn 간의 상호 작용은 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)7 과 바이오-레이어 간섭계 (BLI)10,11이라는 최근에 개발 된 레이블 없는 기술을 사용 하 여 특징 이었다. 반면 ELISAs 단백질 단백질 상호 작용을 확인 하는 데 사용 될 수, 씨는 상호 작용의 운동 매개 변수에 대 한 자세한 데이터를 제공 합니다.
세균성 부착에서 Vn의 기능적 역할을 연구 하기 두 개의 서로 다른 분석을 활용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 첫 번째 분석 결과 두 번째 시험 검사 상피 세포의 표면에 부착 하는 반면 Vn 코팅 유리 표면에 세균성 부착의 직접 측정은. 첫 번째 분석 결과 대 한 유리 슬라이드 했다 Vn, 코팅 그리고 WT 또는 돌연변이 Hif 긴장의 바인딩 그램 얼룩 그리고 현미경 검사 법에 의해 평가 되었다. 이 기술은 쉽게 박테리아가 Vn12바인딩할 능력에 따라 구분 합니다. 포유류 세포에 세균성 접착의 유형 II 치조 상피 세포; 단층에 교양된 박테리아를 추가 하 여 다음 분석 세균성 부착 했다 식민지 형성의 수를 계산 하 여 평가 단위 (CFUs). 준수 하 고 내 면 박테리아는 Vn4,13의 유무에서 고유 수 있습니다.
Vn 수집 세균 혈 청 저항에서의 역할은 혈 청 죽이 분석 결과 (즉, 혈 청 살 균 활동)를 사용 하 여 평가 되었습니다. 혈 청 저항에서 Vn 수집의 중요성을 평가, Vn 고갈 혈 청 (VDS)의 살 균 활동 정상적인 인간 혈 청 (NHS)의 비교 되었다. 쉽게 사용 하는 방법은 혈 청 저항에 따라 구속력이 박테리아 대 Vn-바인딩을 구분 합니다. 우리는 여러 가지 세균성 병원 체4,12의 혈 청 저항에 Vn의 역할을 연구 하기이 방법을 사용.
수많은 방법 호스트 병원 체 상호 작용 연구 보고 되었습니다. 여기, 우리는 적용할 수 있습니다 쉽게 어떤 병원 체의 연구를 병에 Vn의 역할 평가 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 우리는 다양 한 병원 체를 사용 하 여 이러한 프로토콜을 테스트 하 고 Hif이이 보고서에 대 한 예제로 선정 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세균성 병원 체 세포 표면에 Vn 모집를 보완 요인의 증 착 및 막 공격 복잡 한2의 완료를 방지 하기 위해이 보완 레 귤 레이 터. Vn 또한 기능 다리 분자 세균 표면 단백질 사이의 호스트 세포 표면 수용 체, 상피 세포의 표면에 고착 하 고 이후 국제화 중재 하 병원 체를 활성화 합니다. 이 연구에서 혈 청 저항 및의 향상을 제공에 i) 바인딩 Vn의 세균성 세포, ii) 단백질 단백질 상호 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 안 나 재단 에드윈 버거, Lars Hierta, O.E. 및 Edla 요한슨 재단, 스웨덴 의학 연구 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (부여 번호 K2015-57-03163-43-4, www.vr.se), 대학에서 암 재단 말 뫼, Physiographical 사회 (Forssman의 기초), 및 스 코 네 카운티 위원회의 연구 및 개발 재단에 병원.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
Riferimenti
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