Avansert dyremodell av tykktarmsmetastaser i leveren: Imaging teknikker og egenskaper av metastatisk Clones

Summary

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Abstract

Pasienter med et begrenset antall levermetastaser og langsomme satsene for progresjon kan bli vellykket behandlet med lokal behandlingsmetoder ^1,2. Men lite er kjent om heterogenitet av levermetastaser, og dyremodeller som er i stand til å vurdere utviklingen av de enkelte metastatiske kolonier nødvendig. Her presenterer vi en avansert modell av levermetastaser som gir muligheten til å kvantitativt visualisere utvikling av individuelle tumor kloner i leveren og anslå deres vekstkinetikk og kolonisering effektivitet. Vi ga en panel av monoklonale derivater av HCT116 menneskelige kolorektal kreft celler stabilt merket med luciferase og tdTomato og besittelse av ulike vekstegenskaper. Med en milt injeksjon etterfulgt av en splenektomi, de fleste av disse kloner er i stand til å generere levermetastaser, men med forskjellige frekvenser av kolonisering og varierende vekstrater. Bruk av in vivo avbildning system (IVIS), er det mulig å visualisere og kvantifisere metastaseutvikling med in vivo luminescerende og ex vivo fluoriserende billeddannelse. I tillegg Diffus Luminescent Imaging tomografi (DLIT) gir en 3D-fordeling av levermetastaser in vivo. Ex vivo fluoriserende billeddannelse av høstet lever gir kvantitative målinger av individuelle hepatiske metastatiske kolonier, slik at for evaluering av frekvensen av leveren kolonisering og vekstkinetikk av metastaser. Siden modellen er lik klinisk observerte levermetastaser, kan det tjene som en modalitet for påvisning av gener assosiert med levermetastaser og for testing av potensielle ablativ eller adjuvant behandling for levermetastatisk sykdom.

Introduction

Pasienter med levermetastaser fra primær kolorektal kreft (CRC) er preget av en dårlig prognose. Den 5-års overlevelse for primære metastatisk CRC (stadium I – III) er beregnet som 75 – 88% ^3,4, mens pasienter med levermetastaser (stadium IV) har en 5-års overlevelse på bare 8-12% ^{5 6.} Men metastatiske pasienter representerer en heterogen gruppe, presentere med forskjellige antall metastaser og ulike tilbakefall ganger. Kliniske observasjoner indikerer at antallet av metastaser (som kan være proporsjonal med kolon evne eller frekvens for kolonisering) og størrelsen av en enkelt metastaser (proporsjonal med den lokale vekst) er uavhengige prognostiske faktorer ^1,7. Med andre ord, suksess for metastatisk kloner colonizing leveren er avhengig av to viktige egenskaper: deres evne til å vokse og deres evne til å formidle og overleve i leveren mikromiljøet.

Designetav vellykkede kliniske modeller med evne til å fange og kvantifisere egenskapene til metastatiske kloner kan drastisk forbedre vår forståelse av levermetastaser biologi og gi et effektivt verktøy for design av potensielle terapeutiske tilnærminger. Modeller av eksperimentell levermetastaser har tidligere blitt rapportert ^8,9, men ingen av dem gitt evnen til kvantitativt å fange opp og beskrive egenskapene til de enkelte metastatiske kloner både in vivo og ex vivo.

Her presenterer vi en ny, avansert modell av levermetastaser som inkluderer generering av kreft kloner med forskjellige lever kolonisering effektivitet og vekstegenskaper. Vi har anvendt en kombinasjon av to-merking av kreftceller med luciferase og tdTomato fluorescerende protein med generering av monoklonale cellelinjer som har iboende forskjeller i metastatisk kapasitet. I denne eksperimentelle modellen dataene tyder på at utvikling avlevermetastaser kan beskrives i form av kolonisering frekvens og dobling tid (Td), som er konsistent med kliniske observasjoner. Den kvantitative natur denne modellen gjør det lett adoptable for medisiner og diagnostiske formål.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Chicago (protokoll # 72213-09) og utføres under sterile forhold. 1. Forberedelser Gjør 500 ml medium for kultur av HCT116 tumorceller: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, og 100 mg / ml streptomycin. Autoklav instrumentene som skal brukes til milten injeksjonsmodell, inkludert 3 – 4 kirurgiske håndklær, gasbind, to små Ads…

Representative Results

Målet med dette eksperimentet var å etablere en konsistent og lett reproduserbar dyremodell med potensial for den serielle kvantifisering av in vivo metastatisk tumorbelastning og for estimering av den koloniserende frekvens og vekstkinetikk for utvikling av levermetastaser. Figurene 2-6, med legender, finnes fra vår forrige publisering under en Creative Commons CC-BY-lisens 10. Generering …

Discussion

Den dyremodell presenteres i denne rapporten er basert på to viktige tilnærminger. Først, for å sikre evnen til å observere metastatiske kloner med forskjellige tilbøyeligheter til å kolonisere og proliferere i leveren, ble et panel av svært heterogene monoklonale cellelinjer etablert, snarere enn en etablert fraksjonerte kreftcellelinje ^12,13. Det monoklonale tilnærming til metastaseutvikling begrunnes med siste genomiske data ¹⁴ og ble med hell brukt tidligere for å modellere metastatis…

Materials

IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter