Summary
次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。
Abstract
輪部幹細胞欠損（LSCD）は、角膜上皮が結膜に置換された後輪部上皮幹細胞の機能不全または損失の状態です。患者は、再発性角膜欠陥、痛み、炎症、および視力の喪失に苦しみます。
以前は、LSCDのマウスモデルを説明し、2他のモデルと比較しました。目標は、両方の模倣、ヒトにおける表現型とは、疾患の病態生理を研究し、新しい治療法を評価することを可能にするのに十分長く続くLSCDの一貫性のマウスモデルを生成することでした。ここでは、技術は、より詳細に説明します。
回転バリでの電動工具は、角膜表面から錆リングを除去するために、または患者における翼状片のベッドを滑らかにするために設計されています。所望LSCDモデルを作成するのに適した装置です。それはのように、小さな目での作業のために、それが適切になる細かいチップで容易に入手できる、使いやすいツールですマウスインチそのアプリケーションは、眼への不必要な外傷を防止し、多くの場合、化学的損傷モデルの場合と同様に、それは、不要な怪我にはなりません。鈍スクレーパとは対照的に、基底膜と上皮を除去します。このプロトコルでは、輪部領域は2回擦過した後、全体の角膜上皮は、角膜縁から角膜縁に剃毛しました。間質損傷を避けるために、注意が上皮は既に削除された後に角膜表面を磨くしないように注意しました。
Introduction
角膜上皮は角膜の透明性および完全性を維持するために必要とされます。それは、常に角膜や結膜の接合部に輪部の狭いゾーンに存在する上皮幹細胞によって生涯を通じて更新されます。これらの自己再生輪部幹細胞が両方正常および損傷後、角膜上皮の再生に重要な役割を果たしています。これらの幹細胞の部分的または完全な枯渇は、再発性角膜びらん、疼痛、角膜の瘢痕化および血管新生において杯細胞の出現をもたらし、未処理の、角膜失明を残した場合であろう。この条件は、輪部幹細胞欠損（LSCD）として知られており、特発性であり得ます。遺伝性;または起因する化学的または熱的傷害、長期的なコンタクトレンズは着用し、慢性炎症1-6に取得しました。
LSCDに関する研究は、適切な動物モデルを必要とするだけでなく、模倣、ヒトにおける疾患は、しかし、少なくともで、再現性と持続可能です他の角膜および眼の構造への損傷のマウント。このモデルは、治療を評価し、分子および細胞レベルでの疾患のメカニズムを解明することが必要です。 1前に説明したように、回転するバリを使用して、人は簡単上述の利点があり、少なくとも3ヶ月間持続するLSCDのマウスモデルを開発することができます。本研究の目的はLSCDの、簡単な再現性、持続可能なマウスモデルを提示することです。
回転バリが均等に根本的な間質1を傷つけることなく、上皮を除去する便利なツールです。創傷治癒研究において中心角膜びらん7,8を誘導するために使用されてきました。マウスでLSCDを作成するためにここに提示された技術は、以前に報告されていません。以前より回復Oで、不均一で傷害特に輪部と複数の変数の表現型1、9時鈍いスパチュラ結果と上皮を削る方法を導入F正常な角膜上皮1。鈍スクレーパと異なり、回転バリがよく7、8、10などの上皮基底膜を除去します。幹細胞を切断するための他の報告された方法は、下にある眼の構造への不要な損傷を引き起こすことができるだけでなく、有意な炎症およびその後の角膜の混濁またはにつながるだけでなく、水酸化ナトリウム、N-ヘプタノール、及び塩化ベンザルコニウムのような化学物質の使用を含みます上皮の扁平上皮化生11-15。回転バリは、これらの重篤な合併症に関連付けられていません。外科的に輪部上皮を除去し、単独で、または化学物質10、11、16を使用して、実行することがより困難であり、小さな目と（マウスなどの）薄い輪部上皮を有する動物における最良の選択肢ではありません。また、驚くべきことに、limbectomyはまだ10の背後にある輪部上皮の一部を残すことができます。
以下に記載された技術は、血管新生のANとLSCDになります患者における完全なLSCDの提示を模倣し、少なくとも3ヶ月1持続dはconjunctivalization。これは、マウスにおけるLSCDまたは創傷治癒の病態生理、免疫学、および潜在的な治療法を研究することを目指している人に適しています。おそらく、いくつかの修正を加えて、この手順は、ラットまたはウサギ10で行うことができます。回転バリが効率的に上皮を除去するように、角膜上皮摩耗/創傷および関連する治療または分子生物学的研究に関連する任意の研究に利用され得ます。
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Protocol
動物で行わすべての手順は、視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文での研究のための協会に準拠しています。 6ヶ月齢のオス/メスC57BL / 6J野生型マウスへフォーティーン四を使用した：10損傷モデルのためのマウスと対照動物として4（無傷角膜を）。
1.動物の準備
- 100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジン混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。麻酔が反映された後、麻酔の深さを確認するためにつま先をつまみます。動物が反応してはなりません。
- 以前の角膜損傷がないことを確認するために実験を行う前に、スリットランプの下で目を点検します。
- 眼に1％塩酸テトラカインの低下を植え付けます。 60後 - 90秒、感覚がないことを確認するために、角膜反射をテストします。プロパラカイン塩酸塩0.5％を代わりに使用することができます。
- 角膜感覚の損失がある場合特定の、静かに目にし、目の周りの毛に5％ポビドンヨードのドロップを置きます。 1分後にドロップを拭き取るか、ツールチップに干渉から髪を防止するために、目の周りの毛の上に広げました。
2.角膜上皮擦過
- 手術用手袋とガウンを着用してください。無菌回転バリと滅菌ピンセット：必要なツールを準備します。より良い制御のために、曲がったピンセットを使用しています。手順中に滅菌シート上のツールを配置します。
- 曲がったピンセットを使用して、鼻側から蓋をつかみ、そっと目をproptosingことで目を安定させます。あまりにも多くの圧力を使用しないでください。
- 手術用顕微鏡下で、二回滅菌回転バリを使用して、輪部領域の周囲360°を剃ります。ラウンドごとに6秒 - 5の速度で角膜輪部の周りに移動します。
注：バリが1固定速度を持っています。しかし、それは確立された速度で回転するために、「先端ナットは「完全に締めてください。 - 回転バリで角膜輪部に角膜輪部から全体の角膜上皮を削除します。より良い結果を得るために、循環方式でツールを移動し、それが角膜表面に多少の並列先端の側面で動作するように保持します。上皮はすでに削除されていない再ブラッシング領域によって間質を傷つけないように注意してください。眼の上の任意の圧力を加えないでください。必要に応じてブラシの先端を清掃してください。
- 角膜上の滅菌リン酸緩衝生理食塩水のドロップを植え付けると柔らかいクリーニングティッシュで任意の切り離された上皮シートを乾いた布で拭き取ってください。
- もしあれば、残りの上皮を剃ります。
- 手術中にマウス尾に注意してください。
注：任意の動きが発生した場合、麻酔の深さが薄れており、さらなる注入が必要です。一次注入量の三分の二の三分の一は十分なものでなければなりません。麻酔薬で動物を過剰摂取しないでください。 - 別の目でそれらを使用する前に、すべてのツールを滅菌します。
3.完全な上皮削除の確認
- 角膜に1mg / mlのフルオレセインナトリウムの低下を適用します。 30秒後に角膜をきれいにし、上皮の完全な除去を確認するために、コバルトブルーフィルターを用いて、顕微鏡下でそれを調べます。
注：上皮欠損と角膜の領域が緑色に可視化されます。
4.ポスト操作のケア
- 加熱毛布の上に動物を入れて、回復の下ながら（そのケージに、例えば ）安全な場所に保管してください。意識的なものの会社に無意識の動物を保管しないでください。
- 1％のエリスロマイシン眼軟膏を適用します。これはまた、眼の乾燥を防ぐことができます。アプリケーションに一週間のための抗生物質の日常を続けます。
- キロブプレノルフィン皮下処置後にし、再び12時間後/ 0.1ミリグラムを注入します。 2日間一日二回の注射を続けます。
- 麻酔から完全に回復するまで、45分 - 30のための動物を観察します。
注意：回復の下ながら、腹面に呼吸筋の軽度の運動は、動物の健康を示しています。
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Representative Results
この技術を実行した後ヶ月以内に、角膜の100％が（ 図1A。写真は、明視野下でのスリットランプとコバルトブルーフィルターに接続されたカメラで撮影された）表面的な血管新生を開発しました。目の18/20（90％）において、血管新生は、全角膜表面（ 図1A）が関与します。 2/20（10％）で、血管新生が3 4の角膜の象限で観察されたが、それはまだ、角膜中央に達しました。
LSCDの発展を検証するために、ホールマウント免疫染色は、1を行いました。このステップは、プロトコルの一部ではなく、目標や興味に応じて変更することができます。 3つのバリエーションはLSCDの指標として考えられていたサイトケラチン（CK）の欠如12、正常な角膜上皮細胞17、18に特有の中間径フィラメント。 CK8の外観、単純な上皮マーカー
角膜表面-throughout通常、無傷の角膜成熟した角膜上皮細胞17の急行CK12特異的マーカー、18を 、彼らは全体のマウント・サンプル（ 図1B）の角膜側でのCK8や杯細胞（MUC5AC）を欠いています。正常な眼と比較して、CK12の発現はinjurにほとんど存在しません yのモデル角膜、彼らは大幅にCK8のための陽性染色を示し、細胞（ 図1B）を杯ながら。これらの観察は、LSCDの発展を示しています。
免疫染色の結果を定量化することに興味を持っている場合は、別々に同じ設定の下、顕微鏡で撮影したオリジナルの、変更されていない画像に20免疫染色密度を定量化するためにイメージ-Jを使用しています。簡単に言えば、ホールマウント標本の角膜の一部を選択し、その領域のための統合密度と面積を測定し、バックグラウンド20に対して補正密度を計算します。 CK8密度に対するCK12の比は、以前のサンプル1より多くの数の上で発表されました。対照と比較して減少率（正常な角膜）と角膜表面上の杯細胞の出現はLSCDの開発を実証します。
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図1： マウスにおけるLSCDを作成した後、角膜の表現型。細隙灯顕微鏡検査は、全ての角膜は、1ヶ月（：0.5ミリメートルA、スケールバー）によって血管新生のいくつかの程度を開発することを示しています。通常の角膜はすべて、角膜の上にCK12を発現するが、任意のCK8や杯細胞（MUC5AC）を欠いています。 CK8および杯細胞は、角膜（：200μmのB、スケールバー）に表示されている間CK12は、LSCDモデルには存在しません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、LSCDのマウスモデルを作成するための再現性と比較的単純な技術が記載されています。注目に値するこのモデルのいくつかの重要な側面があります。まず、化学物質11を使用する機種、12とは異なり、損傷は主に表面上皮（と基底膜）を含み、下層の角膜実質にまたは他の眼内構造への最小限のダメージで。従って、手順を複雑にし、それがより困難輪部幹細胞を目的とした任意の介入の結果を評価するために行うことができ、どちらも限られた炎症および瘢痕化があります。 Li らによって面白い最近の研究。外科的及び化学的処理の異なる組み合わせで、回転バリの使用を比較10は 、また、バリがウサギにおいてLSCDを作成するより安全でより効果的であることがわかりました。第二に、モデルは、少なくとも最大3ヶ月間1安定であると思われます。このモデルを作成するの使用を含みます回転バリ、角膜と連携臨床医に、だけでなく、マウスの創傷研究を行う者によく知られている楽器。鈍いスパチュラを使用して以上、その利点は、傷害がより均一で再現性の1であるということです。
より良い輪部幹細胞を破壊するために、輪部領域が2回処理しました。マウスの眼に取り組んでの経験に基づいて、以上の2回の治療は、多くの場合、輪部血管を磨耗や出血が発生します。ケースでは技術は他の動物において使用され、このステップは、角膜上皮の厚さに応じて変更されるかもしれません。本研究では、0.5 mmのバリの先端と、電動工具を使用しました。他の形状およびサイズのバリのヒントも利用可能であり、角膜の仕様上、目の大きさに応じて、代わりに使用することができます。 Li ら 。 10は一貫して 、ウサギの角膜や角膜縁上皮を除去するのに適していることが2.5 mmのバリを報告しました。
最適なを取得するにはその結果、角膜縁と角膜上皮は円形に剃られ、バリの側面を使用しました。ツールチップに干渉する動物の毛を防ぐために、ポビドンヨードドロップではなく拭き取るされるので、目の周りの毛に広げました。これは穿孔を引き起こす可能性があるようなツールは、一つの場所で静的に動作させることがないようにしてください。出血をもたらす可能性が非常に遅いペースで輪部を処理します。ラウンド当たり約6秒の速度は、C57BL / 6Jマウスの目に適しています。これはより多くの炎症や間質の不透明化を誘発するように、裸の間質を再ブラッシングを回避することが重要です。上皮を研磨しながら、圧力が眼に適用されるべきではありません。手順の後、角膜は、完全な上皮の除去を確認するために、フルオレセイン色素で染色しました。動物の回復中に目の乾燥を防止することが重要です。制限事項は、この技術は、幹細胞の100％を削除することはできませんということです。また、いくらかのオペレータに依存し、COを与える練習を必要としますnsistent結果。
角膜上皮表現型を研究すると、ホールマウント染色は、このモデルの結果を評価するための最良の方法です。断面は唯一の特定の各セクションについての情報を与えるのに対し、それは、全体の角膜上皮を一度に評価することを可能にするためです。
この制御技術は、同様にマウスにおいて、おそらく他の動物にLSCDを誘導することができます。これは、新規の治療法を研究するために、疾患の病態生理の広い側面を発見するLSCDの適切なモデルを提供します。いくつかの変更を加えて、それは同様に、角膜創傷治癒、血管新生、およびリンパ管新生を研究するのに有用であり得ます。
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Acknowledgments
著者は、イメージングの彼女の寛大な支援のため、ルースZelkha、MSに感謝します。この研究は、ARD、国立眼研究所、NIH、および研究から失明防止への無制限の助成金からコアグラントEY01792への助成金R01のEY024349-01A1、MEに臨床サイエンティスト育成プログラム賞K12EY021475によってサポートされていました。 ARDは失明を防止するための研究からキャリア開発賞を受賞です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
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