Microglies comme un biocapteur Surrogate pour déterminer Nanoparticules neurotoxicité

Summary

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

Abstract

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Introduction

Pollutions environnementales, en particulier celles de la nanoparticule (NP) Plage (1 – diamètre 20 nm), ont été liés à l' obésité et d' autres maladies neurodégénératives en raison de la capacité à traverser la barrière hémato – encéphalique ^1-3. Exposition élevée à la pollution peut induire une inflammation dans le système nerveux central , y compris l'hypothalamus ^1. Un mécanisme potentiel dans lequel cela se produit pourrait être par nanoparticule induite par l' activation de la microglie (cellules immunitaires du cerveau) ^4. Des études antérieures ont utilisé des modèles in vivo pour étudier les effets des IP sur la santé du cerveau qui sont de temps, coûteux, et ne répond pas directement à la question de la façon dont les IP influencent la microglie. Les microglies jouent un rôle multiple dans le système nerveux central, y compris la maintenance du microenvironnement du cerveau et de communiquer avec entourant les neurones via la libération de facteurs sécrétés et cytokines. En fonction des stimuli microglie peut être activé pour une pr M1o-inflammatoire ou un état anti-inflammatoire M2. Par exemple, M1 activé microglie libèrent des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), alors que la microglie activée M2 libèrent des cytokines anti-inflammatoires, y compris l'interleukine-4 (IL-4). Pour valider notre substitut en biocapteur vitro pour déterminer la neurotoxicité des polluants atmosphériques, nous avons mesuré la réponse microgliale 20 nanoparticules d' argent nm (de AGNPS). Le but de cet article est de décrire comment une lignée de cellules microgliales in vitro peut être utilisé comme un marqueur de biocapteur de substitution pour tester la réponse microgliale murine aux IP et comment la microglie activation affecte les cellules hypothalamiques. Le long terme destiné application de ce modèle validé est de tester les effets des polluants du monde réel sur la santé du cerveau et les maladies neurodégénératives. Nous fournissons une description détaillée d'un in vitro essai de 96 puits de format pour mesurer l' activation de la microglie et la survie des cellules hypothalamique suite à l'exposition des micro roglial milieu conditionné.

activation microgliale a été déterminée après une exposition AGNP utilisant une enzyme TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Pour déterminer l'effet de la microglie activée sur les cellules hypothalamiques, les AGNPS ont été retirés du surnageant microgliales (milieu conditionné) en utilisant un dispositif de filtration. Le dispositif de filtration retient les cytokines tout en excluant les AGNPS en fonction de leur taille. En bref, le surnageant de cellules microgliales traitées avec ou sans AGNPS a été recueilli, ajouté aux filtres et centrifugée à 14 000 xg pendant 15 min. Nous étions alors en mesure de déterminer l'influence de cytokines sécrétées microgliales sur la viabilité des cellules hypothalamique. Toxicité cellulaire après une exposition à des milieux conditionnés (contenant des cytokines) a été déterminée par un dosage à base de résazurine, comme décrit précédemment ^5,6. Cellules métaboliquement actives réduisent résazurine et de produire un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules viables ^7.

nt "> Il y a plusieurs avantages de l' utilisation de cette technique par rapport à d' autres (comme co-culture, les configurations trans puits, ou dans des expériences in vivo). Notre modèle offre la possibilité d'activer directement les microglies et de déterminer si les facteurs sécrétés sont toxiques pour les neurones ⁸ . Le protocole actuel utilise immortalisé microglie de BV2 stimulée avec des nanoparticules de 20 nm de diamètre, et cellules immortalisées hypothalamiques murins (désigné mHypo-A1 / 2) ⁹ pour la détermination de la réponse ultérieure. Bien que ce protocole a été optimisé pour ces conditions spécifiques, les méthodes peuvent être modifiées pour être utilisées dans d'autres modèles de la mort cellulaire induite par la microglie, ou avec d'autres types de cellules, y compris les microglies et les neurones primaires.

Protocol

1. microglial Maintenance Cell Culture Milieu de culture cellulaire chaude (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine / néomycine (PSN) à 37 ° C. Obtenir stock congelé des cellules microgliales BV2 au passage 18 – 25 de stockage à -80 ° C. Rapidement décongeler les cellules dans 37 ° C bain d'eau. Le transfert en douceur les cellules dans un flacon de 75 cm2 ventilé conte…

Representative Results

Nous montrons que la fonction microglies comme un biocapteur de substitution pour la réponse du cerveau à des nanoparticules en utilisant le protocole ci-dessus. Nos résultats incluent la mesure des effets toxiques de l' activation de la microglie sur la mort des cellules neuronales en aval. La figure 1 montre un flux de travail du protocole pour activer la microglie et de déterminer si les cytokines sécrétées réduisent la viabilité des neurones hypothalamiq…

Discussion

Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases ^11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity ^13</…

Materials

Cells/Reagents
Mouse microglial cell line (BV2)	Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy)	ATL03001
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	10313-039
Fetal bovine serum	PAA Labs	A15-751
Penicillin/Streptomycin/Neomycin	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Silver nanoparticles (20nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Mouse TNF-α ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L4391
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	S4641
Equipment
96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Molecular Devices	M5
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Corning, Inc	14-432-22
Falcon Cell Strainers 70 μm	Corning, Inc	08-771-2
Tabletop centrifuge 5430	Eppendorf	22620560