Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln
Summary
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
Umweltbelastungen, insbesondere diejenigen der Nanopartikel (NP) Bereich (1 – 20 nm Durchmesser), haben aufgrund der Fähigkeit zur Fettleibigkeit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden 1-3 die Blut – Hirn – Schranke zu überwinden. Erhöhte Exposition gegenüber Verschmutzung kann eine Entzündung im zentralen Nervensystem, den Hypothalamus 1 induzieren. Ein potentieller Mechanismus , bei dem dies geschieht , durch Nanopartikel induzierte Aktivierung von Mikroglia (brain Immunzellen) 4 sein könnte. Frühere Studien haben di – vivo – Modellen verwendet , um die Auswirkungen von Nanopartikeln auf die Gesundheit des Gehirns zu untersuchen , die zeitaufwendig, teuer, und antworten Sie nicht direkt auf die Frage, wie NPs Mikroglia beeinflussen. Mikroglia spielen eine facettenreiche Rolle im zentralen Nervensystem, einschließlich der Wartung des Gehirns Mikroumgebung und die Kommunikation mit Neuronen über die Freisetzung von sekretierten Faktoren und Zytokine umgibt. In Abhängigkeit von den Stimuli können Mikroglia zu einem M1 pr aktivierbaro-entzündliche oder M2 anti-inflammatorische Zustand. Beispielsweise Aktiv M1 lösen Mikroglia proinflammatorische Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), während M2 Mikroglia Freisetzung anti-inflammatorische Zytokine einschließlich Interleukin-4 (IL-4) aktiviert. Um unsere Leihmutter di – vitro – Biosensor zur Bestimmung von Neurotoxizität von Luftschadstoffen zu validieren, wir gemessen Mikroglia Reaktion auf 20 nm Silber – Nanopartikel (AGNPS). Das Ziel dieses Artikels ist es zu beschreiben , wie ein di – vitro – Mikroglia – Zelllinie kann zum Testen murine Mikroglia Reaktion auf NPs und wie Mikrogliaaktivierung wirkt Hypothalamus Zellen als Ersatz Biosensor Marker verwendet werden. Die langfristige beabsichtigte Anwendung dieser validierten Modelleffekte aus der realen Welt Schadstoffen auf die Gesundheit des Gehirns und neurodegenerative Krankheit zu prüfen ist. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-Well – Format – Assay für die im Anschluss an die Belichtung von mic Mikroglia – Aktivierung und hypothalamischen Zellüberlebensmess roglial konditionierten Medien.
Mikrogliaaktivierung wurde nach AgNP Exposition bestimmt einen TNF-α Enzym Linked Immuno Assay (ELISA). Um die Wirkung von aktivierter Mikroglia auf Hypothalamus-Zellen zu bestimmen, wurden die AGNPS von Mikroglia-Überstand (konditioniertes Medium) unter Verwendung einer Filtrationsvorrichtung entfernt. Die Filtervorrichtung behält während Zytokine die AGNPS ohne basierend auf Größe. Kurz gesagt, Überstand aus mit oder ohne AGNPS behandelt Mikroglia wurde zu den Filtern gesammelt, zugegeben und bei 14000 × g für 15 min zentrifugiert. Wir waren dann in der Lage, den Einfluss von Mikroglia-Zytokine auf Hypothalamus die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Zelltoxizität zu konditionierten Medien (enthaltend Zytokine) nach der Belichtung wurde mittels eines Resazurin-basierten Assay bestimmt , wie zuvor beschrieben , 5,6. Metabolisch aktive Zellen reduzieren Resazurin und ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen 7 herzustellen.
nt "> Es gibt mehrere Vorteile dieses Verfahrens gegenüber anderen (zB Co-Kultur, trans-well – Setups oder in vivo – Experimente). Unser Modell die Fähigkeit Mikroglia direkt aktivieren liefert und festzustellen , ob sekretierten Faktoren Neuronen 8 toxisch sind . der aktuelle Protokoll verwendet immortalisierten BV2 Mikroglia mit 20 nm Durchmesser Nanopartikel stimuliert und immortalisierten murinen Hypothalamuszellen (mHypo-A1 / 2 bezeichnet) 9 zur Bestimmung der anschließenden Reaktion. Während dieses Protokoll für diese besonderen Bedingungen optimiert worden ist, können die Verfahren sein , verändert in anderen Modellen der Mikroglia-induzierten Zelltod verwendet werden, oder mit anderen Zelltypen, einschließlich primärer Mikroglia und Neuronen.Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
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