Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder
Summary
Lipider er kendt for at spille en vigtig rolle i cellulære funktioner. Her beskriver vi en fremgangsmåde til bestemmelse lipidsammensætningen af neutrofiler, med vægt på kolesterolniveauet, ved hjælp af både HPTLC og HPLC at få en bedre forståelse af de underliggende mekanismer for neutrofil ekstracellulær fælde dannelse.
Abstract
Lipid analyse udført ved højtydende tyndtlagskromatografi (HPTLC) er en relativt enkel, omkostningseffektiv fremgangsmåde til analyse af et bredt udvalg af lipider. Funktionen af lipider (fx i værtspatogene interaktioner eller vært post) er blevet rapporteret at spille en afgørende rolle i cellulære processer. Her viser vi en metode til at bestemme lipidsammensætning, med fokus på cholesterolniveauet af primære blodafledte neutrofiler ved HPTLC i sammenligning med højtryksvæskechromatografi (HPLC). Formålet var at undersøge rollen af lipid / cholesterol ændringer i dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET). NET frigivelse er kendt som en værtsforsvarsmekanisme at forhindre patogener i at sprede i værten. Derfor blev afledt af blod humane neutrofiler behandlet med methyl-β-cyclodextrin (MβCD) for at inducere lipid forandringer i cellerne. Anvendelse HPTLC og HPLC, har vi vist, at MβCD behandling af cellerne fører til lipidændringer associeret med en signifikant reduktion i indholdet af cellen kolesterol. Samtidig, MβCD behandling af neutrofilerne førte til dannelsen af NET, som vist ved immunfluorescens mikroskopi. Sammenfattende her præsenterer vi en detaljeret metode til at studere lipid ændringer i neutrofiler og dannelsen af NET.
Introduction
Lipider er blevet vist at spille vigtige roller i cellehomøostase, celledød, værtspatogene interaktioner og cytokinfrigørelse 1. Over tid har interesse for og viden om virkningerne af lipider i vært-patogen interaktioner eller inflammation øges, og flere publikationer bekræfter den centrale rolle, som visse lipider, især steroid kolesterol, i cellulære responser. Farmakologisk behandling med statiner, som anvendes som inhibitorer af cholesterolbiosyntese ved at blokere 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reduktase (HMG-CoA-reduktase), kan fungere som anti-inflammatoriske midler ved at sænke serumniveauerne af interleukin 6 og C-reaktivt protein 2. Cholesterol og glycosphingolipid-berigede strukturer kan bruges af flere patogener, såsom bakterier og vira, som en gateway i værten 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sphingolipider (fx sphingomyelin) er blevet vist at blive brugt af patogener til at fremme deres patogenicitet 7. I makrofager, mycobakterier brug cholesterolberiget domæner til indtastning celler; en udtynding af cholesterol hæmmer mycobakteriel optagelse 8. Endvidere infektion af makrofager med Francisella tularensis, en zoonotisk agens ansvarlig for tularemia (også kendt som kanin feber) 9, førte til en infektion, der blev afskaffet når cholesterol blev depleteret fra membranerne 10. Tilsvarende blev invasionen af værtsceller ved Escherichia coli via lipidrige strukturer vist sig at være kolesterol-afhængig 4. Desuden Salmonella typhimurium infektion eksperimenter af epitelceller viste, at cholesterol er afgørende for patogen indtrængen i cellerne 11. Cholesteroldepletering inhibited optagelsen af Salmonella 11. Endvidere en nylig undersøgelse fra gilk et al. viste, at kolesterol spiller en vigtig rolle i optagelsen af Coxiella burnetti 12. Derudover Tuong et al. konstateret, at 25-hydroxycholesterol spiller en afgørende rolle i fagocytose med lipopolysaccharid (LPS) -stimuleret makrofager 13. Fagocytose blev reduceret, når makrofager blev farmakologisk behandlet til nedbryder kolesterol 14. Således, cholesterol og andre lipider synes at spille en vigtig rolle i infektion og inflammation, idet deres udtømning kan reducere risikoen for invasion fra flere patogener 10, 11, 12.
For nylig kunne vi vise, at lipid ombygninger, især udtømningen af cholesterol fra cellen, inducere dannelsen af neutrofil extracellular fælder (net) i humane blodafledte neutrofiler 15. Siden opdagelsen af NET i 2004, har de vist sig at spille kritiske roller i bakteriel indespærring, og dermed i at hindre spredning af smitte 16, 17. NET består af en DNA-rygrad forbundet med histoner, proteaser og antimikrobielle peptider 16. Frigivelse af NET ved neutrofiler kan induceres ved invaderende patogener 18, 19 og kemiske stoffer, såsom phorbol-myristat-acetat (PMA) eller statiner 16, 20. Imidlertid er de detaljerede cellulære mekanismer og især rollen af lipider i denne proces, er stadig ikke helt klar. Analysen af lipider kan føre til en bedre forståelse af de involverede i en lang række af cellulære processer og interaktioner, såsom frigivelse af NET mekanismer. Cholesterol og sphingomyelin er vitale bestanddele i cellemembranen og lipid mikrodomæner, hvor de tilføjer stabilitet og lette klyngedannelse af de involverede protein handel og signalhændelser 21-proteiner. For at undersøge den mekanistiske rolle, som visse lipider, amfifile farmakologiske midler, såsom det cykliske oligosaccharid methyl-β-cyclodextrin (MβCD), kan anvendes til at ændre lipidsammensætningen af en celle og til at reducere kolesterol in vitro 15. Her præsenteres en fremgangsmåde til at bruge HPTLC at analysere lipidsammensætningen af neutrofiler i respons på MβCD. HPLC blev anvendt til at bekræfte niveauet af kolesterol i neutrofile befolkning. Desuden beskriver vi en metode til at visualisere dannelsen af NET ved immunfluorescens mikroskopi i humane blodafledte neutrofiler i respons på MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
De her beskrevne fremgangsmåder kan anvendes til at analysere specifikke lipider, såsom cholesterol, ved HPTLC eller HPLC og at undersøge virkningerne af farmakologiske Lipidforandringer på dannelsen af NET (se Neumann et al. 15).
HPTLC er en relativt omkostningseffektiv og enkel metode til at analysere en lang række lipider i et stort antal prøver. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt i mange forskningsområder, herunder antibiotisk kvantificering <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et fællesskab af Akademie für Tiergesundheit (Aid for Trade) og et stipendium fra ph.d.-studiet, "Animal og zoonotiske infektioner," fra University of Veterinary Medicine, Hannover, Tyskland, forudsat at Ariane Neumann.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
Riferimenti
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
