Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps
Summary
Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.
Abstract
Lipide-analyse uitgevoerd door hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) is een relatief eenvoudige, kosteneffectieve werkwijze voor het analyseren van een breed scala aan lipiden. De functie van lipiden (bijvoorbeeld in gastheer-pathogeen interacties of gastheer entry) is gemeld dat zij een cruciale rol in de cellulaire processen. Hier tonen wij een werkwijze voor lipidesamenstelling te bepalen, met een focus op het cholesterolgehalte primaire bloed afgeleide neutrofielen door HPTLC vergeleken met sterk scheidende vloeistofchromatografie (HPLC). Het doel was om de rol van lipiden / cholesterol veranderingen in de vorming van neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) te onderzoeken. Nettovrijval is bekend als een afweer mechanisme om ziektekiemen te voorkomen verspreiding in de gastheer. Daarom werden bloed-afkomstige humane neutrofielen behandeld met methyl-β-cyclodextrine (MβCD) lipide veranderingen induceren in de cellen. Gebruik HPTLC en HPLC, hebben we aangetoond dat MβCD behandeling van de cellen leidt tot lipideveranderingen geassocieerd met een significante verlaging van het cholesterolgehalte van de cel. Tegelijkertijd, MβCD behandeling van neutrofielen leidde tot de vorming van NET, zoals getoond door immunofluorescentie microscopie. Kortom, hier presenteren we een gedetailleerde methode om lipide veranderingen in neutrofielen en de vorming van de netten te bestuderen.
Introduction
Lipiden is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in cel homeostase, celdood, gastheer-pathogeen interacties, en cytokine release 1. Na verloop van tijd, belangstelling voor en kennis over de impact van lipiden in gastheer-pathogeen interacties of ontsteking zijn toegenomen, en verschillende publicaties bevestigen de centrale rol van bepaalde lipiden, in het bijzonder de steroïde cholesterol, in cellulaire reacties. Farmacologische behandeling met statinen, die als remmers van cholesterol-biosynthese worden door blokkeren van 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reductase (HMG-CoA-reductase), kan fungeren als anti-inflammatoire middelen door verlaging van de serumspiegels van interleukine 6 en C-reactief proteïne 2. Cholesterol en glycosphingolipide verrijkte structuren kan worden gebruikt door verschillende pathogenen, zoals bacteriën en virussen, als toegangspoort tot de host 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sfingolipiden (zoals sfingomyeline) bleken te gebruiken door ziekteverwekkers hun pathogeniciteit 7 bevorderen. In macrofagen, mycobacteriën gebruik cholesterol-verrijkte domeinen cellen binnendringt; een uitputting van cholesterol remt mycobacteriële opname 8. Bovendien infectie van macrofagen met Francisella tularensis, een zooenoseverwekker belast tularemie (ook bekend als konijn koorts) 9, geleid tot een infectie die werd afgeschaft toen cholesterol werd ontdaan van de membranen 10. Ook de invasie van gastheercellen door Escherichia coli via lipide-rijke structuren werd aangetoond dat cholesterol-afhankelijke 4 zijn. Bovendien Salmonella typhimurium besmettingsexperimenten epitheelcellen aangetoond dat cholesterol essentieel pathogeen binnenkomst in de cellen 11. Cholesterol uitputting inhibited de opname van Salmonella 11. Bovendien, een recente studie van Gilk et al. aangetoond dat cholesterol een belangrijke rol bij de opname van Coxiella burnetii 12 speelt. Bovendien Tuong et al. bleek dat 25-hydroxycholesterol een cruciale rol in fagocytose door lipopolysaccharide (LPS) speelt gestimuleerde macrofagen 13. Fagocytose werd verminderd wanneer macrofagen farmacologisch werden getrakteerd op cholesterol 14 afbreken. Zo, cholesterol en andere lipiden lijken een belangrijke rol bij infecties en ontstekingen te spelen, omdat hun uitputting het risico op invasie van een aantal ziekteverwekkers 10, 11, 12 kan verminderen.
Onlangs waren we in staat om aan te tonen dat Lipidenveranderingen, in het bijzonder de uitputting van cholesterol uit de cel, induceren de vorming van neutrofielen extracellular vallen (NET) in menselijk bloed afgeleide neutrofielen 15. Sinds de ontdekking van NET in 2004, hebben ze aangetoond dat cruciale rol spelen in bacteriële beknelling, en dus belemmeren de verspreiding van de infectie 16, 17. NET bestaan uit een DNA skelet geassocieerd met histonen, proteasen en antimicrobiële peptiden 16. De afgifte van het NET door neutrofielen kan worden geïnduceerd door binnendringende ziekteverwekkers 18, 19 en chemicaliën zoals forbol myristaat acetaat (PMA) of statines 16, 20. Echter, de gedetailleerde cellulaire mechanismen, en in het bijzonder de rol van lipiden in dit proces, zijn nog steeds niet helemaal duidelijk. De analyse van de lipiden kan leiden tot een beter begrip van de betrokken in een breed scala van cellulaire processen en interacties, zoals de vrijlating van de netten mechanismen. CholesteRol en sfingomyeline zijn vitale bestanddelen van het celmembraan en lipide microdomeinen, waar stabiliteit toe te voegen en het clusteren van de bij eiwittransport en signaleringsgebeurtenissen 21 eiwitten bevorderen. De mechanistische rol van bepaalde lipiden, amfifiele farmacologische middelen, zoals de cyclische oligosaccharide methyl-β-cyclodextrine (MβCD) onderzoeken kunnen worden toegepast om de lipidesamenstelling van een cel veranderen en cholesterol in vitro 15 verminderen. Hier presenteren we een methode om HPTLC gebruiken om de lipide samenstelling van neutrofielen te analyseren in reactie op MβCD. HPLC werd gebruikt om het niveau van cholesterol in de neutrofielen bevolking te bevestigen. Verder beschrijven we een werkwijze voor de vorming van NET door immuunfluorescentiemicroscopie in menselijk bloed afgeleide visualiseren neutrofielen als reactie op MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke lipiden, zoals cholesterol, door HPTLC of HPLC analyseren en de effecten van farmacologische Lipidenveranderingen op de vorming van NET onderzoeken (zie Neumann et al. 15).
HPTLC is een relatief kosteneffectief en eenvoudige methode om een groot aantal lipiden analyseren van een groot aantal monsters. Deze werkwijze is gebruikt in vele onderzoeksgebieden, waaronder antibiotica kwantifice…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een beurs van de Akademie für Tiergesundheit (HvH) en een beurs van het promotietraject, "Animal and zoönotische infecties," van de Universiteit van Diergeneeskunde, Hannover, Duitsland, verstrekt aan Ariane Neumann.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
Riferimenti
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
