Méthodes d'étude Les modifications lipidiques de neutrophiles et de la formation subséquente des neutrophiles pièges extracellulaires
Summary
Lipides sont connus pour jouer un rôle important dans les fonctions cellulaires. Nous décrivons ici une méthode pour déterminer la composition lipidique des neutrophiles, en mettant l'accent sur le taux de cholestérol, en utilisant à la fois HPTLC et HPLC pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de la formation de piège extracellulaire neutrophile.
Abstract
l'analyse des lipides effectuée par chromatographie sur couche mince haute performance (CCMHP) est une méthode relativement simple et rentable de l'analyse d'une large gamme de lipides. La fonction des lipides (par exemple, dans les interactions hôte-pathogène ou l' entrée hôte) a été signalé à jouer un rôle crucial dans les processus cellulaires. Ici, nous montrons une méthode pour déterminer la composition des lipides, en mettant l'accent sur le taux de cholestérol des neutrophiles primaires dérivés du sang, par HPTLC en comparaison à une Chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L'objectif était d'étudier le rôle des altérations des lipides / cholestérol dans la formation de pièges extracellulaires polynucléaires neutrophiles (TNE). libération NET est connu comme un mécanisme de défense de l'hôte pour empêcher les agents pathogènes de se propager à l'intérieur de l'hôte. Par conséquent, les neutrophiles humains dérivés du sang ont été traités avec du méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) pour induire des altérations lipidiques dans les cellules. En utilisant HPTLC et HPLC, nous avons montré que le traitement MβCD des cellules conduit à des lipidesles modifications associées à une réduction significative de la teneur en cholestérol de la cellule. En même temps, le traitement MβCD des neutrophiles a conduit à la formation de TNE, comme le montre la microscopie immunofluorescence. En résumé, nous présentons ici une méthode détaillée pour étudier les modifications lipidiques dans les neutrophiles et la formation de TNE.
Introduction
Lipids ont été montré à jouer un rôle important dans l' homéostasie cellulaire, la mort cellulaire, les interactions hôte-pathogène et la libération de cytokines 1. Au fil du temps, l'intérêt et les connaissances sur l'impact des lipides dans les interactions hôte-pathogène ou l'inflammation ont augmenté, et plusieurs publications confirment le rôle central de certains lipides, en particulier le cholestérol des stéroïdes, dans les réponses cellulaires. Le traitement pharmacologique avec des statines, qui sont utilisés comme inhibiteurs de la biosynthèse du cholestérol en bloquant 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme-A-réductase (HMG-CoA-réductase), peut agir comme agents anti-inflammatoires en abaissant les taux sériques d'interleukine 6 et de la protéine C-réactive 2. Cholesterol et de structures enrichi glycosphingolipides peuvent être utilisés par plusieurs agents pathogènes tels que des bactéries et des virus, comme une passerelle vers l'hôte 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sphingolipides (par exemple, sphingomyéline) ont été montrées à utiliser par des agents pathogènes pour favoriser leur pathogénicité 7. Dans les macrophages, l'utilisation des mycobactéries domaines enrichi en cholestérol pour pénétrer dans les cellules; une diminution du cholestérol inhibe l' absorption de mycobactéries 8. En outre, l' infection des macrophages avec Francisella tularensis, un agent zoonotique responsable de la tularémie (également connu sous le nom de fièvre de lapin) 9, a conduit à une infection qui a été aboli lorsque le cholestérol a été appauvri des membranes 10. De même, l'invasion de cellules hôtes de Escherichia coli par l' intermédiaire de structures riches en lipides a été démontrée comme dépendante de cholestérol 4. De plus, Salmonella expériences d'infection typhimurium des cellules épithéliales ont montré que le cholestérol est essentiel pour l' entrée des agents pathogènes dans les cellules 11. épuisement du cholestérol inhibited l'absorption de Salmonella 11. De plus, une étude récente de Gilk et al. a démontré que le cholestérol joue un rôle important dans l'adoption de Coxiella burnetii 12. De plus, Tuong et al. a révélé que 25 hydroxycholestérol joue un rôle crucial dans la phagocytose par lipopolysaccharide (LPS) 13 macrophages stimulées. Phagocytose a été réduite lorsque les macrophages ont été traités sur le plan pharmacologique pour appauvrir le cholestérol 14. , Semblent cholestérol et d' autres lipides ainsi jouer un rôle important dans l' infection et l' inflammation, car leur épuisement peut réduire le risque d'invasion de plusieurs agents pathogènes 10, 11, 12.
Récemment, nous avons pu montrer que les altérations lipidiques, en particulier l'épuisement du cholestérol de la cellule, induire la formation de neutrophile milieu extracellulairepièges r (TNE) dans les neutrophiles du sang d'origine humaine 15. Depuis la découverte de TNE en 2004, ils ont démontré qu'ils jouent un rôle essentiel dans le piégeage des bactéries, et donc à entraver la propagation de l' infection 16, 17. TNE sont constitués d'un squelette d'ADN associée à des histones, des protéases, et des peptides antimicrobiens 16. La libération des EVF par des neutrophiles peut être induite par des agents pathogènes envahissant 18, 19 et des substances chimiques telles que le phorbol-myristate-acétate (PMA) ou les statines 16, 20. Cependant, les mécanismes cellulaires détaillés, et en particulier le rôle des lipides dans ce processus, ne sont pas encore tout à fait clair. L'analyse des lipides peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une grande variété de processus cellulaires et les interactions, telles que la libération de TNE. CholesteROL et sphingomyéline sont des constituants essentiels des membranes cellulaires et des lipides, microdomaines où ils ajoutent la stabilité et facilitent le regroupement des protéines impliquées dans le trafic des protéines et des événements de signalisation 21. Pour étudier le rôle mécanique de certains lipides amphiphiles, des agents pharmacologiques, tels que la méthyl-β-cyclodextrine oligosaccharide cyclique (MβCD), peut être utilisé pour modifier la composition lipidique d'une cellule et pour réduire le cholestérol in vitro 15. Nous présentons ici une méthode pour utiliser HPTLC pour analyser la composition lipidique des neutrophiles en réponse à MβCD. HPLC a été utilisé pour confirmer le taux de cholestérol dans la population neutrophile. De plus, nous décrivons une méthode pour visualiser la formation de TNE par microscopie immunofluorescence dans les neutrophiles dérivés du sang humain en réponse à MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites ici peuvent être utilisés pour analyser les lipides spécifiques, tels que le cholestérol, par HPTLC ou HPLC et d'étudier les effets des modifications lipidiques pharmacologiques sur la formation de TNE (voir Neumann et al. 15).
HPTLC est une méthode relativement rentable et simple d'analyser une large gamme de lipides dans un grand nombre d'échantillons. Cette méthode a été utilisée dans de nombreux domaines de r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de l'Akademie für Tiergesundheit (AFT) et une bourse du programme de doctorat, « animale et infections zoonotiques » de l'Université de médecine vétérinaire de Hanovre, en Allemagne, fourni à Ariane Neumann.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
Riferimenti
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