Summary

Metoder for å studere Lipidendringer av nøytrofile granulocytter og etterfølgende dannelse av Neutrofil Ekstracellulær feller

Published: March 29, 2017
doi:

Summary

Lipider er kjent for å spille en viktig rolle i cellulære funksjoner. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å bestemme lipid sammensetningen av neutrofiler, med vekt på kolesterolnivået, ved å bruke både HPTLC og HPLC for å få en bedre forståelse av de underliggende mekanismene for nøytrofil ekstracellulær felle dannelse.

Abstract

Lipid analyser utført ved høy-ytelses tynnsjiktkromatografi (HPTLC) er en forholdsvis enkel, kostnadseffektiv metode for å analysere et bredt spekter av lipider. Funksjonen av lipider (for eksempel i vert-patogen interaksjoner eller vert inngang) er blitt rapportert å spille en avgjørende rolle i cellulære prosesser. Her viser vi en fremgangsmåte for å bestemme lipid sammensetning, med en vekt på kolesterolnivået av primære blodavledede nøytrofiler, ved HPTLC i sammenligning med høy ytelse væskekromatografi (HPLC). Formålet var å undersøke rollen til lipid / kolesterol endringer i dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (garn). NET frigivelse er kjent som en vertsforsvarsmekanisme for å hindre patogener i å spre seg inne i verten. Derfor, blodavledede humane neutrofiler ble behandlet med metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) for å indusere lipid forandringer i cellene. Ved hjelp av HPTLC og HPLC, har vi vist at MβCD behandling av cellene fører til lipidforandringer assosiert med en signifikant reduksjon i kolesterol-innholdet i cellen. På samme tid, MβCD behandling av de nøytrofile celler førte til dannelse av garn, som vist ved immunofluorescens-mikroskopi. I sammendraget, her presenterer vi en detaljert metode for å studere lipid endringer i nøytrofile granulocytter og dannelsen av Nets.

Introduction

Lipider har vist seg å spille en viktig rolle i celle homeostase, celledød, host-patogen interaksjoner, og cytokin frigjørings en. Over tid har interesse for og kunnskap om virkningen av lipider i host-patogen interaksjoner eller betennelse økt, og flere publikasjoner bekrefter den sentrale rollen av visse lipider, spesielt steroid kolesterol, i cellulære responser. Farmakologisk behandling med statiner, som brukes som inhibitorer av kolesterolbiosyntese ved blokkering av 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym-A-reduktase (HMG-CoA-reduktase), kan fungere som anti-inflammatoriske midler ved å senke serumnivået av interleukin 6 og C-reaktivt protein 2. Kolesterol- og Glycosfingolipid anriket strukturer kan brukes av flere patogener, slik som bakterier og virus, som en inngangsport til verten 3, 4, 5,class = "ekstern referanse"> 6. Sfingolipider (f.eks, sfingomyelin) er blitt vist å bli brukt av patogener for å fremme deres patogenitet 7. I makrofager, mykobakterier bruk kolesterolanriket domener for å komme inn i cellen; en reduksjon av kolesterol hemmer mycobakteriell opptak 8. Videre infeksjon av makrofager med Francisella tularensis, en zoonotisk middel ansvarlig for tularemia (også kjent som kanin feber) 9, førte til en infeksjon som ble opphevet når kolesterol ble uttømt fra membranene 10. På lignende måte ble det invasjon av vertsceller med Escherichia coli via fettrike konstruksjoner vist seg å være kolesterol-avhengige 4. Dessuten, Salmonella typhimurium smitteforsøk av epitelceller viste at kolesterol er avgjørende for patogen adgang inn i cellene 11. Kolesterol uttømming inhibited opptaket av Salmonella 11. Videre en fersk undersøkelse utført av Gilk et al. viste at cholesterol spiller en viktig rolle i opptaket av Coxiella burnetti 12. I tillegg Tuong et al. funnet at 25-Hydroxycholesterol spiller en avgjørende rolle i fagocytose av lipopolysakkarid (LPS) -stimulerte makrofager 13. Fagocytose ble redusert når makrofager ble farmakologisk behandlet for å utarme kolesterol 14. Således, kolesterol og andre lipider synes å spille en viktig rolle i inflammasjon og infeksjon, siden deres utarming kan redusere risikoen for invasjon fra flere patogener 10, 11, 12.

Nylig var vi i stand til å vise at Lipidendringer, spesielt uttømming av kolesterol fra celle, indusere dannelsen av nøytrofil extracellular feller (garn) i humane, blodavledede nøytrofiler 15. Siden oppdagelsen av garn i 2004, har de vist seg å spille viktige roller i bakterie entrapment, og dermed i å hindre spredning av smitte 16, 17. NET består av en DNA-ryggrad forbundet med histoner, proteaser, og antimikrobielle peptider 16. Frigjøringen av garnene med nøytrofiler kan induseres av invaderende patogener 18, 19 og kjemiske substanser som forbol-myristat-acetat (PMA) eller statiner 16, 20. Men de detaljerte cellulære mekanismene, og spesielt den rollen av lipider i denne prosessen, er fortsatt ikke helt klart. Analysen av lipider kan føre til en bedre forståelse av de som er involvert i en rekke forskjellige cellulære prosesser og interaksjoner, for eksempel frigjøring av NET mekanismer. Cholesterol og sfingomyelin er viktige bestanddeler i cellemembranen og lipid mikrodomener, hvor de legger stabilitet og lette gruppering av de som er involvert i proteinhandel og signaleringshendelser 21 proteiner. For å undersøke den mekanistiske rolle av visse lipider, amfifile farmakologiske midler, så som cyklisk oligosakkarid metyl-β-cyklodekstrin (MβCD), kan brukes til å endre den lipidsammensetningen av en celle og for å redusere kolesterol in vitro 15. Her presenterer vi en metode for å bruke HPTLC for å analysere den lipidsammensetningen av nøytrofiler som respons på MβCD. HPLC ble brukt til å bekrefte nivået av kolesterol i nøytrofile befolkningen. Videre beskriver vi en fremgangsmåte for å visualisere dannelsen av nett ved immunofluorescens-mikroskopi i humane, blodavledede nøytrofiler som respons på MβCD.

Protocol

Samlingen av perifert blod i denne protokollen ble godkjent av lokale menneskelige forskningsetikk provisjon. Alle mennesker gitt sin skriftlig informert samtykke. 1. Isolering av human blodavledede Neutrophils ved densitetsgradientsentrifugering Isolering av humane, blodavledede nøytrofiler Lag ~ 20 ml blod på 20 ml av natrium-diatrizoat / dekstranoppløsning nær en flamme og uten blanding. Sentrifuger i 30 minutter ved 470 x g uten brems. <…

Representative Results

Humane, blodavledede neutrofiler ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering (figur 2). For å undersøke virkningen av lipid forandringer ved neutrofiler ble cellene behandlet med 10 mM MβCD, som tømmes kolesterol fra cellen. Deretter ble lipidene isolert fra prøvene etter Bligh og Dyer (figur 1, venstre panel), som beskrevet av Brogden et al. 23. De fremstilte lipid prøvene ble applisert på silikagel HPTLC-plat…

Discussion

Metodene som beskrives her, kan brukes til å analysere bestemte lipider, så som kolesterol, ved HPTLC eller HPLC, og for å undersøke effektene av farmakologiske Lipidendringer på dannelsen av NET (se Neumann et al. 15).

HPTLC er et forholdsvis kostnadseffektiv og enkel metode for å analysere et bredt spekter av lipider i et stort antall prøver. Denne metoden har vært brukt i mange forsknings- områder, inkludert antibiotika kvantifisering <sup class="…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap av Akademie für Tiergesundheit (AFT) og et fellesskap fra PhD-programmet, "Animal og Zoonotiske infeksjoner," ved University of Veterinary Medicine, Hannover, Tyskland, gitt til Ariane Neumann.

Materials

Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG Invitrogen A-21070
Anti-MPOα antibody Dako A0398
BSA Sigma-Aldrich 3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber Celeromics MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner Leica DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10X Sigma-Aldrich P5493-1L Dilute 1:10 in water for 1X working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed Thermo Fisher Scientific 35503
Excel Microsoft 2010
DNA/Histone 1 antibody Millipore MAB3864
Image J NIH 1.8 http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope VWR 630-1554
Methyl-β-cyclodextrin Sigma-Aldrich C4555-1G
PFA Carl Roth 0335.3 dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution
PMA Sigma-Aldrich P8139-1MG Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Polymorphprep AXIS-SHIELD AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Invitrogen P7581
RPMI1640 PAA E 15-848
HBSS with CaCl and Mg Sigma H6648
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ml
Trypanblue Invitrogen 15250-061 0.4% solution
Water Carl Roth 3255.1 endotoxin-free
Name Company Catalog Number  Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol Sigma-Aldrich 33538
10 µl syringe Hamilton 701 NR 10 µl
Diethyl ether Sigma-Aldrich 346136
Ethyl acetate Carl Roth 7336.2
Canullla 26G Braun 4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate Merck 1027805000
Chloroform Carl Roth 7331.1
CP ATLAS software Lazarsoftware 2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column Merck 152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster Hitachi HITA 892-0080-30Y Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector Hitachi 5410
HPLC Column Oven Hitachi 5310
HPLC Auto Sampler Hitachi 5260
HPLC Pump Hitachi 5160
Methanol Carl Roth 7342.1
n-Hexane Carl Roth 7339.1
Phosphoric acid Sigma-Aldrich 30417
Potassium chloride Merck 49,361,000
Potters LAT Garbsen 5 ml
SDS Carl Roth CN30.3
HPTLC silica gel 60 Merck 105553
Vacufuge plus basic device Eppendorf 22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom Sigma CLS3548
Coverslip Thermo Fisher Scientific 1198882
Glass slide Carl Roth 1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 ml BD Bioscience 309659

Riferimenti

  1. Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
  2. Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
  3. Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
  4. Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
  5. Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
  6. Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
  7. Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
  8. Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
  9. Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
  10. Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
  11. Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
  12. Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
  13. Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
  14. Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
  15. Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
  16. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  17. von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
  18. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  19. Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
  20. Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  21. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
  22. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  23. Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
  24. Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
  25. Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
  26. Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
  27. Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
  28. Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
  29. Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
  30. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
  31. Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
  32. Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
  33. Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
  34. Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
  35. Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
  36. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  37. Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
  38. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  39. Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
  40. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Brogden, G., Neumann, A., Husein, D. M., Reuner, F., Naim, H. Y., von Köckritz-Blickwede, M. Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps. J. Vis. Exp. (121), e54667, doi:10.3791/54667 (2017).

View Video