Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Summary

Lipídios são conhecidos por desempenhar um papel importante nas funções celulares. Aqui, descrevemos um método para determinar a composição lipídica de neutrófilos, com ênfase sobre o nível de colesterol, usando tanto HPTLC e HPLC para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da formação armadilha extracelular de neutrófilos.

Abstract

análise de lípidos realizada por cromatografia em camada fina de elevado rendimento (HPTLC) é um método relativamente simples e de baixo custo para analisar uma larga gama de lipidos. A função dos lípidos (por exemplo, em interacções hospedeiro-patogénio ou entrada de acolhimento) tem sido relatada a desempenhar um papel crucial em processos celulares. Aqui, mostramos um método para determinar a composição lipídica, com um foco no nível de colesterol de neutrófilos derivados do sangue primárias, por HPTLC em comparação com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O objectivo foi o de investigar o papel das alterações de lípido / colesterol na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETS). libertação líquida é conhecido como um mecanismo de defesa do hospedeiro para evitar a propagação de agentes patogénicos no interior do hospedeiro. Portanto, os neutrófilos humanos derivadas do sangue foram tratadas com metil-β-ciclodextrina (MβCD) para induzir alterações lipídicas nas células. Usando HPTLC e HPLC, que demonstraram que o tratamento MβCD das células leva a lipídicoalterações associadas com uma redução significativa no teor de colesterol da célula. Ao mesmo tempo, o tratamento MβCD dos neutrófilos levou à formação de redes, como mostrado por microscopia de imunofluorescência. Em resumo, aqui se apresenta um método detalhado para estudar alterações lipídicas em neutrófilos e a formação de redes.

Introduction

Os lípidos foram mostrados para desempenhar um papel importante na homeostase celular, morte celular, as interacções hospedeiro-patogénio, e libertação de citoquinas ^1. Ao longo do tempo, o interesse eo conhecimento sobre o impacto dos lipídios na interação patógeno-hospedeiro ou inflamação têm aumentado, e várias publicações confirmam o papel central de certos lipídios, especialmente o colesterol esteróide, em respostas celulares. O tratamento farmacológico com estatinas, que são utilizados como inibidores da biossíntese do colesterol através do bloqueio 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A-redutase (HMG-CoA-redutase), podem actuar como agentes anti-inflamatórios, diminuindo os níveis séricos de interleucina 6 e proteína C-reactiva ^2. Colesterol e estruturas enriquecido-glicoesfingolipídeos pode ser utilizado por vários agentes patogénicos, tais como bactérias e vírus, como uma porta de entrada para o hospedeiro ^{3, 4, 5,}class = "xref"> 6. Os esfingolípidos (por exemplo, esfingomielina) foram mostrados para ser usado por agentes patogénicos para promover a sua patogenicidade ^7. Em macrófagos, domínios para entrar nas células uso micobactérias colesterol enriquecido; uma diminuição do colesterol inibe a absorção de micobactérias ^8. Além disso, a infecção de macrófagos com Francisella tularensis, um agente zoonótica responsável pela tularemia (também conhecida como febre do coelho) ^9, levou a uma infecção que foi abolido quando o colesterol foi descarregada a partir das membranas ^10. Da mesma forma, a invasão de células hospedeiras de Escherichia coli por meio de estruturas ricas em lípidos foi demonstrado ser ⁴ dependente de colesterol. Além disso, a Salmonella typhimurium experiências de infecção de células epiteliais demonstrado que o colesterol é essencial para a entrada de agentes patogénicos para as células ^11. Colesterol a inibição da exaustãod a absorção de Salmonella ^11. Além disso, um estudo recente por Gilk et al. demonstrou que o colesterol desempenha um papel importante na captação de Coxiella burnetti ^12. Além disso, Tuong et al. encontrado que 25-hidroxicolesterol desempenha um papel crucial na fagocitose por lipopolissacarídeo (LPS) estimuladas por macrófagos ^13. Fagocitose foi reduzida quando os macrófagos foram tratados farmacologicamente para esgotar colesterol ^14. Assim, colesterol e outros lípidos parecem desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, uma vez que seu esgotamento pode reduzir o risco de invasão de vários patógenos ^{10, 11, 12.}

Recentemente, fomos capazes de mostrar que as alterações lipídicas, especialmente o esgotamento de colesterol do celular, induzir a formação de extracellula neutrófilosarmadilhas r (NETS) em neutrófilos derivados do sangue humano ^15. Desde a descoberta de redes em 2004, eles foram mostrados para desempenhar papéis críticos na armadilha bacteriana, e, portanto, impedindo a propagação da infecção ^{16, 17.} NET consistem num esqueleto de ADN associado com histonas, proteases, e péptidos antimicrobianos ^16. A libertação das redes por neutrófilos pode ser induzido por patogénios invasores ^{18, 19} e às substâncias químicas, tais como de forbol-miristato-acetato (PMA) ou estatinas ^{16, 20.} No entanto, os mecanismos celulares detalhados, e especialmente o papel dos lipídios neste processo, ainda não são totalmente claras. A análise de lípidos pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em uma grande variedade de processos e interacções celulares, tais como a libertação de NET. CholesteRol e esf ingomielina são constituintes importantes das microdomínios da membrana celular e de lípidos, onde eles agregam estabilidade e facilitar a aglomeração das proteínas envolvidas no tráfico de proteína e eventos de sinalização ^21. Para investigar o papel mecanicista de certos lípidos, agentes farmacológicos anfifílicos, tais como o oligossacarídeo cíclico metil-β-ciclodextrina (MβCD), pode ser usado para alterar a composição lipídica de uma célula e para reduzir o colesterol in vitro ^15. Aqui, apresentam-se um método para utilizar HPTLC para analisar a composição lipídica de neutrófilos em resposta a MβCD. HPLC foi usada para confirmar o nível de colesterol na população de neutrófilos. Além disso, descreve-se um método para visualizar a formação de redes por microscopia de imunofluoresccia nos neutrófilos derivado de sangue humano em resposta a MβCD.

Protocol

A coleta de sangue periférico neste protocolo foi aprovado pela comissão de ética em pesquisa humanos local. Todos os seres humanos desde que o seu consentimento informado por escrito. 1. Isolamento de neutrófilos humanos de sangue derivadas por centrifugação em gradiente de densidade Isolamento de neutrófilos derivados do sangue humano Camada de ~ 20 ml de sangue para 20 ml de diatrizoato / solução de dextrano de sio perto de uma chama e sem mis…

Representative Results

Neutrófilos derivados do sangue humano foram isolados por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2). Para investigar o efeito de alterações lipídicas sobre os neutrófilos, as células foram tratadas com 10 mM de MβCD, que esgota o colesterol a partir da célula. Subsequentemente, os lípidos foram isolados a partir das amostras por Bligh e Dyer (Figura 1, painel da esquerda), como descrito por Brogden et al. 23…

Discussion

Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para analisar os lípidos específicos, tais como colesterol, por HPTLC ou HPLC e para investigar os efeitos de alterações lipídicas farmacológicos sobre a formação de redes (ver Neumann et ai. ^15).

HPTLC é um método relativamente de baixo custo e simples para analisar uma larga gama de lipidos em um grande número de amostras. Este método tem sido usado em muitas áreas de investigação, incluindo qua…

Materials

Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-21070
Anti-MPOα antibody	Dako	A0398
BSA	Sigma-Aldrich	3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber	Celeromics	MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner	Leica	DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10X	Sigma-Aldrich	P5493-1L	Dilute 1:10 in water for 1X working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed	Thermo Fisher Scientific	35503
Excel	Microsoft	2010
DNA/Histone 1 antibody	Millipore	MAB3864
Image J	NIH	1.8	http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope	VWR	630-1554
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	C4555-1G
PFA	Carl Roth	0335.3	dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution
PMA	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Polymorphprep	AXIS-SHIELD	AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	Invitrogen	P7581
RPMI1640	PAA	E 15-848
HBSS with CaCl and Mg	Sigma	H6648
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ml
Trypanblue	Invitrogen	15250-061	0.4% solution
Water	Carl Roth	3255.1	endotoxin-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol	Sigma-Aldrich	33538
10 µl syringe	Hamilton	701 NR 10 µl
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	346136
Ethyl acetate	Carl Roth	7336.2
Canullla 26G	Braun	4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate	Merck	1027805000
Chloroform	Carl Roth	7331.1
CP ATLAS software	Lazarsoftware	2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column	Merck	152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster	Hitachi	HITA 892-0080-30Y	Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector	Hitachi	5410
HPLC Column Oven	Hitachi	5310
HPLC Auto Sampler	Hitachi	5260
HPLC Pump	Hitachi	5160
Methanol	Carl Roth	7342.1
n-Hexane	Carl Roth	7339.1
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich	30417
Potassium chloride	Merck	49,361,000
Potters	LAT Garbsen	5 ml
SDS	Carl Roth	CN30.3
HPTLC silica gel 60	Merck	105553
Vacufuge plus basic device	Eppendorf	22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom	Sigma	CLS3548
Coverslip	Thermo Fisher Scientific	1198882
Glass slide	Carl Roth	1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 ml	BD Bioscience	309659