Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек
Summary
Липиды, как известно, играют важную роль в клеточных функций. Здесь мы опишем метод для определения липидного состава нейтрофилов, с акцентом на уровень холестерина, как с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и ВЭТСХ, чтобы получить лучшее понимание основных механизмов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Abstract
Анализ липидов проводили методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) является относительно простым, экономически эффективным методом анализа широкого спектра липидов. Функция липидов (например, в хозяин-патоген взаимодействий или записи хоста), как сообщается, играют важную роль в клеточных процессах. Здесь мы покажем метод для определения состава липидов, с акцентом на уровень холестерина в крови первичных производных нейтрофилов, по ВЭТСХ по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Цель состояла в том, чтобы исследовать роль изменений липидов / холестерина в формировании нейтрофильных внеклеточных ловушек (НРТ). NET релиз известен как механизм защиты хозяина, чтобы предотвратить патогены от распространения в пределах хоста. Таким образом, полученные из крови человека нейтрофилов обрабатывали метил-бета-циклодекстрин (MβCD), чтобы вызвать изменения липидов в клетках. Использование ВЭТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии, мы показали, что MβCD обработка клеток приводит к липидаизменения, связанные со значительным снижением содержания холестерина в клетке. В то же время, MβCD обработка нейтрофилов приводило к образованию сетки, как показано иммунофлюоресценции микроскопии. Таким образом, здесь мы приводим детальный метод изучения липидного изменения в нейтрофилах и образования ИХ.
Introduction
Липиды было показано, играют важную роль в гомеостазе клетки, клеточной гибели, хозяин-патоген взаимодействия и высвобождение цитокинов 1. Со временем интерес к и знание о влиянии липидов в хост-патоген взаимодействий или воспаления увеличились, и несколько публикаций подтверждают центральную роль некоторых липидов, особенно холестерина стероид, в клеточных реакций. Фармакологическое лечение статинов, которые используются в качестве ингибиторов биосинтеза холестерина, блокируя 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент-A-редуктазу (ГМГ-КоА-редуктаза), может выступать в качестве противовоспалительных агентов пути снижения уровней в сыворотке крови интерлейкина 6 и С-реактивный белок 2. Холестерином и гликосфинголипид обогащенные структуры могут быть использованы несколькими патогенами, такими как бактерии и вирусы, в качестве шлюза в хост 3, 4, 5,класс = "внешние ссылки"> 6. Сфинголипиды (например, сфингомиелина), была показана для использования патогенов в целях содействия их патогенности 7. В макрофагах, использование микобактерии холестерин обогащенных доменов для ввода клеток; истощение холестерина ингибирует поглощение микобактерий 8. Кроме того, инфекция макрофагов с Francisella tularensis, зоонозного агента , ответственного за туляремии (также известный как лихорадка кролика) 9, привело к инфекции , которая была отменена , когда уровень холестерина был исчерпан из мембран 10. Аналогичным образом , вторжение в клетки – хозяина с помощью кишечной палочки богатых липидами структур было показано, что холестерин-зависимые 4. Кроме того, Salmonella Typhimurium инфекции опыты эпителиальных клеток показали , что холестерин необходим для вступления патогенных микроорганизмов в клетки 11. Холестерин истощение inhibiteд поглощение Salmonella 11. Кроме того, недавнее исследование Gilk и соавт. показали , что холестерин играет важную роль в поглощении Coxiella burnetti 12. Кроме того, Туонг и др. Обнаружено , что 25-hydroxycholesterol играет решающую роль в фагоцитозе липополисахарида (LPS) -стимулированных макрофаги 13. Фагоцитоз был уменьшен , когда макрофаги обрабатывали фармакологически истощать холестерин 14. Таким образом, холестерин и другие липиды , кажется, играют важную роль в инфекции и воспалении, так как их истощение может уменьшить риск вторжения от нескольких патогенов , 10, 11, 12.
В последнее время мы смогли показать, что липидные изменения, особенно истощением холестерина из клетки, индуцирует образование нейтрофилов extracellulaг ловушка (сетки) в крови человек , полученные нейтрофилах 15. С момента открытия НЭО в 2004 году, они были показаны , чтобы играть решающую роль в бактериальной провокации, и , таким образом , в препятствует распространению инфекции 16, 17. НРТ состоят из основной цепи ДНК , связанной с гистонов, протеазы и антимикробных пептидов 16. Выпуск Сетки нейтрофилами могут быть вызваны вторжения патогенных микроорганизмов 18, 19 и химические вещества , такие как форбол-миристат-ацетата (РМА) или статины 16, 20. Однако подробные клеточные механизмы, и особенно роль липидов в этом процессе, все еще не совсем понятно. Анализ липидов может привести к лучшему пониманию механизмов, участвующих в самых разнообразных клеточных процессов и взаимодействий, таких как освобождение сетками. Cholesteрол и сфингомиелином являются жизненно важными компонентами клеточных мембран и липидных микродоменов, где они добавляют стабильности и облегчают кластеризацию белков , вовлеченных в незаконный оборот белка и события 21 сигнализации. Для того, чтобы исследовать механистическую роль определенных липидов, амфифильных фармакологических агентов, такие как циклический олигосахаридов метил-бета-циклодекстрин (MβCD), может быть использовано для изменения липидного состава клетки и уменьшить содержание холестерина в пробирке 15. Здесь мы представляем метод использовать ВЭТСЙ для анализа липидного состава нейтрофилов в ответ на MβCD. ВЭЖХИ использовали для подтверждения уровня холестерина в популяции нейтрофилов. Кроме того, мы опишем метод, чтобы визуализировать образование сеток с помощью иммунофлуоресценции микроскопии в крови человека, полученных нейтрофилов в ответ на MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы , описанные здесь , могут быть использованы для анализа конкретных липидов, таких как холестерин, от ВЭТСХ или ВЭЖХ и исследовать эффекты фармакологических липидных изменений на формирование НЭО (см Нейман и др. 15).
ВЭТСХ является относительно эк?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана общении Akademie für Tiergesundheit (AFT) и стажер из программы PhD, «животных и зоонозных инфекций,» Университета ветеринарной медицины, Ганновер, Германия, предоставило Ариан Нейман.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
Riferimenti
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
