Fremstilling and Drug Delivery Anvendelser af Silk Nanopartikler

Summary

Nanopartikler dukker op som lovende drug delivery systemer til en bred vifte af indikationer. Her beskriver vi en simpel endnu kraftfulde metode til at fremstille silke nanopartikler anvendelse af omvendt manipuleret Bombyx mori silke. Disse silke nanopartikler kan let fyldes med en terapeutisk nyttelast og efterfølgende undersøgt for lægemiddeltilførselsanvendelser.

Abstract

Silke er en lovende biopolymer til biomedicinske og farmaceutiske anvendelser på grund af dets enestående mekaniske egenskaber, biokompatibilitet og bionedbrydelighed, samt dets evne til at beskytte og efterfølgende frigive sit nyttelast som svar på en udløser. Mens silke kan formuleres i forskellige materialer formater, er silke nanopartikler fremstår som lovende lægemiddeltilførselssystemer. Derfor er denne artikel dækker procedurerne for reverse engineering silke kokoner at give en regenereret silke løsning, der kan bruges til at generere en stabil silke nanopartikler. Disse nanopartikler efterfølgende karakteriseret, lægemiddel fyldte og udforsket som en potentiel anticancer lægemiddelafgivelsessystem. Kort fortalt silkekokoner revers manipuleret først ved degumming kokoner fulgt af opløsning silke og rydde op, hvilket gav en vandig silke opløsning. Dernæst den regenererede silke opløsning underkastes nanoprecipitation til opnåelse silke nanopartikler – en simpel men kraftfuld metodeder genererer ensartede nanopartikler. Silke nanopartikler karakteriseres efter deres størrelse, zetapotentialet, morfologi og stabilitet i vandige medier, samt deres evne til at indeslutte et kemoterapeutisk nyttelast og dræbe humane brystcancerceller. Samlet set den beskrevne metode giver ensartede silke nanopartikler, der let kan udforskes til et utal af applikationer, herunder deres anvendelse som en potentiel nanomedicin.

Introduction

Nanostørrelse lægemiddeladministrationssystemer anvendes ofte til at styre lægemiddelfrigivelse og levere et bredt sæt af nyttevirkning – for eksempel proteiner, peptider og lille molekylvægt lægemidler – at målrette celler og væv. Disse terapeutiske nyttelast er ofte medtaget i forskellige makromolekylære lægemiddelbærere såsom liposomer, vandopløselige polymerer (herunder dendrimerer) og mikro- og nanopartikler ^1. Nanopartikler (typisk i en størrelsesorden på 1 nm til 1000 nm) bliver meget undersøgt som potentielle lægemiddelbærere, især for anticancer drug delivery ^2. Den vellykkede indførelse af Abraxane (120 nm størrelse albumin-nanopartikler fyldt med paclitaxel) i almindelig klinisk praksis ³ har katalyseret marken, så mange flere nanopartikler til lægemiddeladministration går nu ind kliniske forsøg ^4. Solide tumorer viser generelt dårlig lymfedrænage og har utætte blodkar, som betyder, at nanoparticles på op til 200 nm, vil blive passivt rettet mod disse tumorer efter intravenøs administration. Denne passive targeting fænomen kaldes den forbedrede permeabilitet og retention (EPR) virkning og blev først rapporteret i 1986 ^5. EPR effekt kan føre til en 50- til 100-fold stigning i medikamentkoncentrationer i tumormikromiljøet for en given dosis lægemiddel, når lægemidlet nyttelast afgives ved anvendelse af en makromolekylær lægemiddel carrier tilgang frem for den frie lægemiddel uden bæreren. Drug nanopartikler designet til anticancer drug delivery skal nå tumormikromiljøet og ofte skal indtaste en bestemt intracellulært, sædvanligvis ved endocytisk optagelse, for lægemidlet for at opnå den ønskede terapeutiske virkning ^3. Nanopartikler er konstrueret til intracellulær lægemiddelafgivelse udnytte endocytose som en gateway i cellen samt en rute til at overvinde drug resistensmekanismer. Lægemiddelfrigivelse fra nanopartikler ofte specielt designet til at occur i lysosomer (dvs. lysosomotropiske drug delivery) ^6, hvor pH reaktionsevne nanopartikel luftfartsselskab (lysosomal pH ca. 4,5) kan tjene som udløser for narkotika release eller lysosomale enzymer, som frigør nyttelasten fra bæreren ^7.

Mange forskellige klasser af materialer kan anvendes til at generere nanopartikler (f.eks, metaller og mange organiske og uorganiske materialer). Imidlertid er biopolymerer fremstår som attraktive materialer på grund af deres kendte biokompatibilitet, bionedbrydelighed og lav toksicitet ^8. Mange biopolymerer bliver undersøgt, herunder albumin, alginat, chitosan og silke. Heraf har silke dukket op som en lovende udfordrer til udvikling i drug delivery-systemer ^9. Silke af forskellige typer produceres af en række leddyr, herunder edderkopper (f.eks Nephila clavipes) og silkeorme (f.eks Bombyx mori). Avlen silke bruges langt mere EXTENkende end edderkop silke fordi avlen er helt tamme og silke repræsenterer således en reproducerbar udgangsmateriale. Avlen silke er en Food and Drug Administration (FDA) godkendt materiale til humant brug, især som suturmateriale; det har en robust sikkerhed rekord i mennesker, og er kendt for at nedbryde in vivo ^10. Nedbrydningen profil silke kan finjusteres til at variere fra time (lav krystallinsk silke) til 12 måneder eller mere (høj krystallinsk silke). Silke nedbrydningsprodukter er ugiftige og metaboliseres i legemet ^10. Den silke struktur bibringer evnen til at binde små molekylvægt forbindelser og makromolekylære protein narkotika ^11, hvilket gør det et godt materiale til kontrolleret frigivelse af lægemiddel. Proteinlægemidler (f.eks antistoffer) er modtagelige for denaturering, aggregering, proteolytisk spaltning og clearance af immunsystemet. Imidlertid silke stabiliserer terapeutiske proteiner grundet bufferkapacitet dens nanokrystallinske reregioner og dens evne til at skræddersy vandindhold på nanoskala ^11. Disse unikke funktioner giver fysisk beskyttelse og reducerer nyttelasten mobilitet ¹¹ og er typisk ikke set med andre (bio) polymerer. Mange anticancer lægemiddelafgivelsessystemer, f.eks silke-baserede hydrogeler ^12, film ^13-15 og nanopartikler ^16,17, er nu blevet udviklet til at udnytte disse funktioner (revideret i referencer ^18,19)

Her blev silke nanopartikler karakteriseret ved at bestemme deres størrelse og ladning over et forlænget tidsrum. Doxorubicin, en klinisk relevant anticancer narkotika, blev brugt som model lægemiddel til lægemiddel lastning og cytotoksicitet studier i tredobbelt negative humane brystkræftceller behandlet med narkotika-loaded silke nanopartikler.

Protocol

1. Udarbejdelse af en Reverse-manipuleret Silk Solution fra Bombyx mori Kokoner BEMÆRK: Denne metode er baseret på protokoller beskrevet andetsteds 12,27. Skær 5 g tørrede kokoner med en saks i 5 mm x 5 mm stykker. Fjern eventuelle snavsede lag. Afvej 4,24 g natriumcarbonat og tilføje denne omhyggeligt til 2 l kogende destilleret vand. BEMÆRK: Dette giver en 0,02 M natriumcarbonatopløsning. Tilsæt cut kokon brikkerne til det kogende natriumcarbona…

Representative Results

Data blev statistisk analyseret som beskrevet tidligere 17. Den t-test blev anvendt til prøvepar og envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Bonferronis multipel sammenligning post hoc test for multiple prøver. En stjerne angiver statistisk signifikans således: * P <0,05 og ** P <0,001. Alle data præsenteres som middelværdier ± standardafvigelse (SD) og tallene i parentes angiver antallet af uafhængige forsøg. <p class="jove_content" fo:keep-together.withi…

Discussion

Forskellige fremgangsmåder er tilgængelige til at producere silke nanopartikler, herunder polyvinylalkohol blande ^20, spraytørring ^21, udsaltning ^22, kapillær microdot udskrivning ^23, superkritisk _CO2 udfældning ²⁴ og nanoprecipitation ^16,25 (gennemgået i henvisning ^26). Imidlertid nanoprecipitation, på grund af sin samlede enkelhed, er den mest populære metode til generering silke nanopartikler. Derfor er formålet med denne…

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system