Un metodo per l'RNA di misura N 6 -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

Summary

Un metodo di blotting nord modificato per misurare N ⁶ -methyladenosine (m ⁶ a) delle modifiche in RNA è descritto. L'attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.

Abstract

N 6-Metiladenosina (m⁶A) Le modifiche dell'RNA sono diverse e onnipresenti tra gli eucarioti. Si verificano in mRNA, rRNA, tRNA e microRNA. Studi recenti hanno rivelato che queste modifiche reversibili dell'RNA influenzano lo splicing, la traduzione, la degradazione e la localizzazione dell'RNA. Molteplici processi fisiologici, come i ritmi circadiani, la pluripotenza delle cellule staminali, la fibrosi, il metabolismo dei trigliceridi e l'obesità sono controllati anche dalle modificazioni m⁶A. L'immunoprecipitazione/sequenziamento, la spettrometria di massa e il northern blotting modificato sono alcuni dei metodi comunemente impiegati per misurare le modifiche di m⁶A. Qui, presentiamo una tecnica di blotting nord-orientale per misurare le modifiche di m⁶A. L'attuale protocollo fornisce una buona separazione dimensionale dell'RNA, una migliore accomodazione e standardizzazione per vari disegni sperimentali e una chiara delineazione delle modifiche di m⁶A in varie fonti di RNA. Mentre è noto che le modificazioni m⁶A hanno un impatto cruciale sulla fisiologia umana in relazione ai ritmi circadiani e all'obesità, il loro ruolo in altri stati (pato)fisiologici non è chiaro. Pertanto, le indagini sulle modificazioni di m⁶A hanno un'immensa possibilità di fornire informazioni chiave sulla fisiologia molecolare.

Introduction

Le modifiche dinamiche e reversibili dell'RNA hanno un ruolo importante nell'omeostasi dell'RNA. Quattro decenni fa, le modifiche della N 6-metiladenosina (m⁶A) sono risultate abbondanti nei trascrittomi eucariotici¹. Hanno diverse funzioni nell'RNA messaggero (mRNA), nell'RNA ribosomiale (rRNA), nell'RNA nucleolare piccolo, nell'RNA di trasferimento e nel microRNA². Le modificazioni m⁶A dell'mRNA influenzano il loro splicing³, la traduzione⁴, la degradazione⁵ e la localizzazione². Inoltre, influenzano la biogenesi dei ribosomi e la funzione dei microRNA⁶. La conservazione evolutiva delle modificazioni dell'RNA m⁶A è nota nei batteri unicellulari negli esseri umani pluricellulari⁷. La delineazione dei ruoli delle modifiche m⁶A è attualmente oggetto di un'ampia esplorazione. Si prevede che gli sforzi forniranno nuove informazioni sul controllo della trascrizione. Studi recenti rivelano che anche altre modifiche chimiche dell'mRNA⁸ svolgono un ruolo critico nel metabolismo dell'RNA.

I ritmi circadiani⁹, la pluripotenza delle cellule staminali¹⁰, il metabolismo dei trigliceridi⁴, la fibrosi¹¹, l'obesit๲ e la depressione maggiore¹³ sono alcuni esempi di processi in cui le modifiche m⁶A sono note per controllare i risultati. Molti trascritti del gene dell'orologio circadiano hanno siti m⁶A¹⁴. La modulazione della m⁶A metilasi o della demetilasi provoca variazioni del periodo circadiano¹⁵. Mettl3, una m⁶A transferasi, è un regolatore per la pluripotenza delle cellule staminali. Una carenza di Mettl3 porta a una letalità embrionale precoce e a un priming aberrante del lignaggio nella fase^{post-impianto 10}. Un deficit di massa grassa e obesità associata (FTO), una m⁶A demetilasi, negli adipociti influenza la mobilizzazione degli acidi grassi e il peso corporeo attraverso la regolazione posttrascrizionale di Angptl4⁴. Questi studi rivelano che l'm⁶A non solo controlla l'elaborazione dell'mRNA, ma svolge anche un ruolo critico nello sviluppo embriologico e nella fisiopatologia. La funzione delle modificazioni m⁶A ha implicazioni per le considerazioni terapeutiche in futuro.

Sono disponibili diversi metodi per misurare le modifiche m⁶A dell'RNA^16-18. Tradizionalmente, la cromatografia su strato sottile (TLC) e la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) sono utilizzate per studiare la distribuzione di m⁶A in diversi RNA^19,20. La spettrometria di massa è uno strumento sensibile per la rilevazione di modificazioni m⁶A nell'RNA. Tuttavia, l'RNA deve essere asportato dalla RNasi in brevi frammenti prima dell'analisi mediante spettrometria di massa²¹. L'immunoprecipitazione e il sequenziamento del metil-RNA (m⁶A-Seq)²² immunoprecipita gli RNA frammentati con anticorpi m⁶A-specifici ed esegue il sequenziamento parallelo dell'RNA. Questo metodo genera paesaggi di m⁶A a livello di trascrittoma. La mappatura ad alta risoluzione di m⁶A con risoluzione a singolo nucleotide (miCLIP) mappa ulteriormente le modifiche di m⁶A con una risoluzione a singolo nucleotide²³. Entrambi i metodi forniscono dettagli sulla modifica di m⁶A nell'intero trascrittoma, con informazioni specifiche sui geni. Tuttavia, le quantificazioni e la standardizzazione in entrambi i metodi sono difficili se gli esperimenti richiedono il confronto di più condizioni. Inoltre, le frammentazioni dell'RNA per m⁶A-Seq alterano la struttura originale dell'RNA, che può influenzare i livelli nativi di m⁶A. Per rilevare le modificazioni globali dell'RNA m⁶A e i loro cambiamenti in diverse condizioni sperimentali, riportiamo un metodo che impiega un protocollo di northern blotting modificato. Questo metodo risolve l'RNA in base al peso molecolare, utilizzando l'elettroforesi su gel¹⁸. Questa procedura fornisce una migliore standardizzazione e quantificazione per gli esperimenti che coinvolgono più condizioni o campioni. Fornisce inoltre informazioni specifiche sulla modifica m⁶A per diversi RNA, siano essi rRNA, mRNA o microRNA.

Protocol

NOTA: L'RNA totale m ⁶ A livello comprende rRNA, mRNA, e altri piccoli RNA. Dal momento che l'RNA ribosomiale è abbondante m ⁶ modifiche A, la misura di m ⁶ livelli A dovranno prendere in considerazione questo fatto.

Isolamento 1. RNA

1. Utilizzando la soluzione di decontaminazione ribonucleasi (spruzzato su tovaglioli di carta), pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio. asciugamani di carta bagnati con acqua priva di nucleasi e pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio di nuovo.
2. RNA Estrazione
   1. Isolamento RNA totale
      1. Utilizzando un agitatore, mescolare 50-100 mg di tessuto o 5-10 x 10 ⁶ cellule in 1 ml di soluzione di isolamento dell'RNA mantenuti a 4 ° C.
         NOTA: più tessuto (100-150 mg) può essere richiesto per i campioni di tessuto adiposo di topi a causa delle concentrazioni di RNA inferiori in esso. I campioni provengono da cuore del mouse, fegato, muscolo scheletrico, polmone, cervello e macrofagi sono stati impiegati in precedenza ^4.
      2. Incubate omogenati di esempio per 5 min a temperatura ambiente.
      3. Aggiungere 100 ml di 1-bromo-3-cloropropano (BCP) per 1 ml di omogenato del campione. Agitare le provette con forza per 15 s e procedere per isolare l'RNA totale secondo le istruzioni ²⁴ del produttore.
   2. Poliadenilato mRNA Purificazione da RNA totale isolato
      1. Purificare mRNA poliadenilato utilizzando kit o protocolli disponibili.
         1. Agitare accuratamente per risospendere ciascuna delle seguenti soluzioni: soluzione vincolante, oligo (dT) perle di polistirene, e soluzione di lavaggio 2x. Assicurarsi che il oligo (dT) perline calda a temperatura ambiente prima dell'uso.
         2. Trasferire 120 ml di soluzione di eluizione per la preparazione in un tubo e si riscalda a 70 ° C su una piastra riscaldante.
         3. Pipetta fino a 500 mg di RNA totale in una provetta. Con l'acqua priva di nucleasi, regolare il volume a 250 ml.
         4. Aggiungere 250 ml di soluzione vincolante 2x alla RNA totale cosìluzione e brevemente vortex per mescolare il contenuto.
         5. Aggiungere 15 ml di oligo (dt) perline e vortex accuratamente per mescolare.
         6. Incubare la miscela a 70 ° C per 3 min.
         7. Rimuovere il campione dal blocco di riscaldamento e lasciar riposare a temperatura ambiente per 10 min.
         8. Centrifugare a 15.000 xg per 2 min.
         9. Rimuovere con attenzione il surnatante, lasciando dietro di sé circa 50 ml.
         10. Aggiungere 500 ml di soluzione di lavaggio per risospendere il pellet pipettando.
         11. Pipettare la sospensione in un set di tubi filtro rotativo / collezione.
         12. Centrifugare a 15.000 xg per 2 min. Rimuovere la colonna dal tubo di raccolta e scartare il flow-through. Riportare la colonna a tubo di raccolta.
         13. Pipettare 500 ml di soluzione di lavaggio sul filtro rotativo.
         14. Centrifugare a 15.000 x g per 2 minuti.
         15. Trasferire il filtro rotativo in un tubo di raccolta fresca.
         16. Pipettare 50 ml di soluzione di eluizione riscaldataa 70 ° C sul centro del filtro rotativo.
         17. Incubare per 2-5 minuti a 70 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 1 min.
         18. Pipettare un ulteriore 50 ml di soluzione di eluizione riscaldata a 70 ° C sul centro del filtro rotativo.
         19. Ripetere il passo 1.2.2.1.18.
      2. Aggiungere 100 mg glicogeno / mL, 0,1 volumi di tampone di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo assoluto. Precipitato durante la notte a -80 ° C.
      3. Centrifugare a 15.000 xg per 25 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
      4. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C. Rimuovere con attenzione l'etanolo.
      5. A secco in aria per 3-5 minuti.
      6. Aggiungere 10 ml di acqua priva di nucleasi per dissolvere il pellet.
      7. Conservare a -70 ° C.
3. RNA qualificazione e quantificazione
   1. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la concentrazione di RNA da noting l'assorbanza a 260 nm e 280 nm. Il rapporto A ₂₆₀ / A ₂₈₀ dovrebbe essere 1,8-2,2.
   2. Controllare la qualità del campione di RNA utilizzando 0,8% gel elettroforesi ^25.
      NOTA: L'RNA totale eucariotica intatto dovrebbe mostrare intense bande 28S e 18S rRNA. Il rapporto di 28S contro intensità banda 18S rRNA per una buona preparazione RNA è ~ 2.

2. elettroforesi su gel e di trasferimento

NOTA: I protocolli di preparazione del buffer sono riportati nella tabella 1.

1. Formaldeide Gel di Preparazione (1%)
   1. Risciacquare tutte le apparecchiature elettroforesi con dietilpirocarbonato acqua (DEPC).
   2. Sciogliere 2.5 g di agarosio in 215 mL di acqua DEPC completamente in un forno a microonde.
   3. Aggiungere 12,5 ml di 10x 3- (N-morfolino) propanosulfonico (MOPS) buffer e 22,5 ml di formaldeide al 37%.
   4. Versare il tutto nell'apparecchio elettroforesi con un pettine 1,5 mm di spessore.
   5. Eliminare le bolle o spingere torlo per i bordi del gel con un pettine pulito.
   6. Lasciare il gel solidificare a temperatura ambiente.
2. Preparazione del campione
   1. Mescolare 1-10 mg di RNA totale e 11,3 ml di tampone campione.
   2. Mescolare 2 ug del marcatore RNA (1 mg / mL) con 11.3 ml di tampone campione.
   3. Aggiungere acqua priva di nucleasi ai campioni da 2.2.1 e 2.2.2 ad un volume totale di 16 microlitri.
   4. Riscaldare a 60 ° C per 5 minuti, e poi raffreddare su ghiaccio.
   5. Mescolare 16 microlitri del campione da 2.2.3 con 4 ml di colorante inseguimento, che contiene 0,1 mg / mL di bromuro di etidio in ghiaccio.
      ATTENZIONE: il bromuro di etidio è forse teratogeno e tossico se inalato. Leggi bromuro di etidio scheda di sicurezza.
3. elettroforesi
   1. Aggiungere 200 ml di 10x tampone MOPS a 1.800 ml di DDH ₂ O per fare un tampone di corsa 1x MOPS.
   2. Utilizzare il tampone di corsa 1x MOPS per sciacquare i pozzetti del gel.
   3. Pre-run tegli gel a 20 V per 5 min.
   4. Caricare i campioni di RNA nei pozzetti del gel.
   5. Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Eseguire a 35 V per circa 17 ore (durante la notte)
   6. Esaminare e fotografare il gel sotto una luce UV.
4. Trasferimento
   1. Tagliare il gel per rimuovere la parte non utilizzata.
   2. Preparare 500 ml di 10x tampone SSC (250 mL di 20x tampone SSC e 250 mL di acqua DEPC).
   3. Lavare il gel due volte con 10x tampone SSC per 20 minuti con agitazione a 50 giri al minuto.
   4. Tagliare 1 filtro foglio di carta grande abbastanza per servire come una carta stoppino, che assorbe buffer di trasferimento dalla sezione Trasferimento (Figura 1).
   5. Tagliare 4 pezzi di carta da filtro per la stessa dimensione del gel.
   6. Tagliare 1 foglio di membrana di nylon caricata positivamente alla stessa dimensione come il gel.
   7. Tracciare una tacca sul gel e la membrana come marcatore per assicurare il corretto orientamento.
   8. Immergere la membrana in tampone SSC 2x per 15 min.
   9. Versare 500 ml of 10x SSC tampone nel cassetto di trasferimento.
   10. Disporre il grande foglio di carta filtrante attraverso la piastra di vetro e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento.
   11. Stendete le bolle con una pipetta.
   12. Immergere 2 pezzi di carta da filtro pre-tagliati in buffer di trasferimento e metterli al centro della carta da filtro dal punto 2.4.5. Rimuovere eventuali bolle.
   13. Posare il gel superiore rivolto verso il basso sulla carta da filtro.
   14. Disporre la membrana sulla superficie del gel. Allineare le tacche del gel e la membrana.
   15. Mettere 2 pezzi di carta filtro pre-taglio sulla parte superiore della membrana e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento.
   16. Rimuovere eventuali bolle tra gli strati.
   17. Applicare pellicola intorno al gel di garantire che gli asciugamani assorbono solo fino tampone passa attraverso il gel e la membrana.
   18. Stack i tovaglioli di carta sulla parte superiore della carta da filtro.
   19. Inserire un lastra di vetro di grandi dimensioni sulla parte superiore degli asciugamani.
   20. Collocare un peso in cima alla pila.
   21. Mantenere notte per consentire l'RNA di trasferire dal gel alla membrana.

3. Rilevamento di N ⁶ -methyladenosine

1. membrana reticolazione
   1. Mantenere la membrana umida nel tampone 2x SSC.
   2. Mettere 2 fogli di carta da filtro immersa con 10x SSC tampone in reticolante UV.
   3. Posizionare la membrana sulla parte superiore della carta da filtro, con il lato di RNA-adsorbito rivolto verso l'alto.
   4. Selezionare "modalità autocrosslink" (120.000 μJ) e premere il pulsante "Start" per avviare l'irradiazione.
   5. Esaminate la membrana ed il gel con UV immagine Gel collettore per confermare il trasferimento RNA dal gel alla membrana.
2. immunoblotting
   1. Bloccare la membrana in latte scremato 5% in soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST) tampone a temperatura ambiente per 1 ora.
   2. Lavare tre volte con tampone TBST per 15 min.
   3. Incubare la membrana durante la notte in m ⁶ A ( soluzione N ⁶ -methyladenosine) anticorpo (1: 1.000 in 5% senza grassi del latte tampone TBST) a 4 ° C.
   4. Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min.
   5. Incubare la membrana nella soluzione HRP-coniugato asino anti-coniglio anticorpo (1: 2.000 in tampone latte TBST 5% non grassa) per 1 ora a temperatura ambiente.
   6. Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min.
   7. Applicare il substrato chemiluminescente potenziato (0,125 ml per cm ² di membrana).
   8. Cattura il chemiluminescenza con le impostazioni ottimali del imager digitale, secondo le istruzioni del produttore ^26.
3. m ⁶ una quantificazione
   1. Misurare la relativa m ⁶ A intensità chemiluminescente utilizzando il software ImageJ.
      1. Sotto il menu del software ImageJ, selezionare l'opzione "File" per aprire il file pertinente.
      2. Selezionare lo strumento "Rettangolo" da ImageJ e disegnare una cornice intornoi segnali.
      3. Se RNA ribosomiale non è il focus degli esperimenti, evitare le 18S e 28S RNA ribosomiale m ⁶ fasce A per il calcolo.
      4. Fai clic su "Comando" e "1" per confermare la corsia selezionato.
      5. Premere il tasto "Comando" e "3" per mostrare la trama selezionata.
      6. Fare clic sullo strumento "Straight" e tracciare le linee per separare l'area segmentata.
      7. Fare clic sullo strumento "Bacchetta" per registrare le misurazioni.
      8. Esportare i dati.
      9. Normalizzare i livelli di m ⁶ A con la 18S RNA ribosomiale banda dalla colorazione bromuro di etidio.

Results

Dopo 14 giorni nel normale fase circadiana luce-buio, i topi wild-type sono stati collocati in buio costante. Gli RNA dal fegato sono stati campionati ad intervalli di 4 ore e studiate con modificato blotting settentrionale. La metilazione di rRNA, mRNA, e piccoli RNA erano chiaramente rilevata (Figura 2). Il confronto tra differenti tempi circadiani (CT) può essere accuratamente calcolata con lo standard 18S rRNA. C'era robusta oscillazione circadiana di m ⁶ livelli A in rRNA, mRNA, e piccoli RNA.

Per evitare l'interferenza offerto da rRNA, RNA poliadenilato possono essere purificate, come al punto 1.2.2. Dopo la purificazione, l'rRNA può essere sostanzialmente eliminato per consentire una migliore visualizzazione di altri RNA (Figura 3).

g> Figura 1: Montaggio della unità di trasferimento macchia. è indicata l'unità di trasferimento capillare per asciugare l'RNA alla membrana. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: il ritmo circadiano delle m ⁶ levels in C57BL / 6J. Questa figura mostra la m ⁶ A blot di RNA totale da fegati di topi wild-type sacrificato il primo giorno della fase dark-scuro dopo 14 giorni di una normale fase leggera-buio a 4 h intervalli. La quantificazione è stata effettuata utilizzando il m ⁶ A differenza di densità delle immagini tra 18S e 28S rRNA. La m ⁶ A abbondanza stato normalizzato alla banda 18S rRNA dal gel formaldeide in basso.et = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: I m ⁶ una macchie con o senza rRNA. Rappresentante m sono mostrati ⁶ una macchie del totale RNA e l'RNA poliadenilato dal fegato di topi wild-type. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Tamponi e soluzioni.

1	10x tampone MOPS (pH 7,0, proteggere dalla luce)
	MOPS			41.85	g	0.2 M
	Acetato di sodio			4.1	g	0,05 M
	EDTA, Disodium Salt			3.7	g	0,01 M
	acqua DEPC
	Totale			1	L
	Mescolare a temperatura ambiente
2	20x tampone SSC (pH 7,0)
	Cloruro di sodio			175,3	g	3 M
	citrato trisodico			88.3	g	0.3 M
	acqua DEPC
	Totale			1	L
	Mescolare a temperatura ambiente, poi in autoclave
3	Dye monitoraggio
	Buffer 10x MOPS			500	microlitri	1x
	Ficoll 400			0.75	g	15%
	bromofenolo blu			0.01	g	0,2%
	xilene cianolo			0.01	g	0,2%
	acqua DEPC
	Totale			5	mL
	Conservare a -20 ° C
4	acqua DEPC
	Diluire il rapporto a 1: 1.000 di DEPC in DDH 2 O
	Mescolare notte a temperatura ambiente, poi in autoclave
5	tampone campione (riparo dalla luce)
	Buffer 10x MOPS			200	microlitri
	37% di formaldeide			270	microlitri
	formammide			660	microlitri
	Conservare a -20 ° C

Discussion

Le modifiche dell'RNA hanno un ruolo importante nella funzione e nella fisiologia cellulare. L'attuale comprensione della regolazione, della funzione e dell'omeostasi di queste modifiche è ancora in fase di esplorazione^{e ampliamento}. Pertanto, è necessario un metodo preciso e gold standard per valutare le modifiche dell'RNA. Il metodo del northern blotting modificato fornisce una quantificazione precisa delle modifiche dell'RNA e una chiara delineazione delle modifiche nei diversi RNA. Sebbene il metodo richieda almeno 3 giorni, può essere standardizzato e può essere utilizzato in vari disegni sperimentali. Inoltre, con diversi anticorpi, può rilevare diverse modificazioni dell'RNA²⁷.

È importante separare i diversi RNA quando si analizzano le modifiche dell'RNA. L'RNA ribosomiale comprende gran parte della quantità totale di RNA^28,29. I risultati dell'analisi delle modifiche dell'RNA solo nell'RNA totale rappresenteranno principalmente le variazioni dell'rRNA. La metilazione e altre modifiche simili dell'rRNA potrebbero potenzialmente mascherare i cambiamenti in altri RNA. Con la procedura di separazione su gel, le modifiche dell'mRNA e di altri piccoli RNA possono essere analizzate in modo più accurato.

La mappatura dell'intero trascrittoma con immunoprecipitazione e sequenziamento di m⁶A fornisce informazioni dettagliate sulla modifica di ciascun tipo di RNA²². Fornisce informazioni sugli RNA specifici e una risoluzione di circa 80-120 bp. Sebbene m⁶A-Seq possa confrontare le modifiche tra diverse condizioni sperimentali, la selezione di standard e controlli appropriati per tali esperimenti è difficile¹⁸. L'immunoprecipitazione è difficile da riprodurre, spesso con variazioni significative tra le ripetizioni. Inoltre, m⁶A-Seq richiede la frammentazione di campioni di RNA prima dell'immunoprecipitazione e del sequenziamento³⁰. Il processo di frammentazione potrebbe potenzialmente indurre influenze indebite sulle modifiche originali dell'RNA. Se l'esperimento non ha bisogno delle informazioni specifiche del gene ma richiede condizioni diverse per il confronto, il metodo attuale fornisce una migliore visualizzazione e controllo per diverse configurazioni sperimentali.

La modifica dell'RNA è un passo importante nella regolazione del controllo trascrizionale³¹. Tuttavia, l'omeostasi e i meccanismi di regolazione di varie modificazioni dell'RNA in diversi ambiti fisiologici non sono ancora chiari. Utilizzando l'attuale metodo del northern blotting modificato, è possibile quantificare e confrontare diverse modificazioni dell'RNA. Inoltre, i cambiamenti e le regolazioni delle modificazioni dell'RNA possono essere studiati in modo più dettagliato. In futuro, potrebbe anche essere possibile combinare i dati sperimentali provenienti sia dal northern blotting classico che dai protocolli di northern blotting modificati, fornendo maggiori informazioni sulla biologia dell'RNA.

Il fattore più importante che determina il successo del protocollo di northern blotting modificato è l'integrità del campione di RNA. Gli RNA con una certa quantità di degradazione possono produrre buoni risultati di northern blotting classico, ma questo potrebbe potenzialmente avere un impatto significativo sui risultati del northern blotting modificati. Anche le modifiche dell'RNA in diversi tessuti o linee cellulari potrebbero variare in modo significativo. È importante testare i carichi di campioni di RNA adatti per i diversi tessuti prima di eseguire gli esperimenti finali.

Poiché le procedure di blotting sono state tradizionalmente denominate in onore del Dr. Southern e di diverse direzioni geografiche, proponiamo il nome di blotting "nord-orientale" per la tecnica attuale.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione RNaseZap	Ambion	AM9782	Protocollo 1.1
TRI Soluzione reagente	Ambion	AM9738	Protocollo 1.2.1.1
1-Bromo-3-cloropropano (BCP)	Sigma	B9673	Protocollo 1.2.1.3
Etanolo	JTbaker	8006	Protocollo 1.2.1.3
Isopropanolo	Sigma	I9516	Protocollo 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocollo 1.2.2.1
Glicogeno	Ambion	AM9510	Protocollo 1.2.2.2
Acetato di sodio	Fluka	71183	Protocollo 1.2.2.2
Acqua priva di nucleasi	Ambion	AM9930	Protocollo 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocollo 2.1.1
Agarosio	JT Baker	Protocollo A426	2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocollo 2.1.3
Soluzione di formaldeide al 37%	Sigma	F8775	Protocollo 2.1.3
EDTA, sale disodico	JT Baker	8993	Protocollo 2.1.3 10x MOPS
tampone formammide	Sigma	F7503	Protocollo 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocollo 2.2.2
Bromuro di etidio	Amresco	X328	Protocollo 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocollo 2.2.5 colorante tracciante
Blu bromofenolo	Sigma	114391	Protocollo 2.2.5 colorante tracciante
Xilene Cianolo FF	Sigma	X4126	Protocollo 2.2.5 colorante tracciante
Cloruro di sodio diidrato	JT Baker	3624	Protocollo 2.4.2 20x tampone SSC
Citrato trisodico	Sigma	S1804	Protocollo 2.4.2 20x tampone SSC
Carta assorbente	GE Healthcare		Protocollo RPN6101M 2.4.4
Membrana GE Hybond-N+ Protocollo	GE Healthcare	RPN303B	2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocollo 3.1.2
Gel Catcher 1500	Tecnologia ANT	Gel Catcher 1500	Protocollo 3.1.5
Anti-m6A (N6-metiladenosina)	Sistemi sinaptici	202003	Protocollo 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd intero Ab	GE Healthcare	NA934	Protocollo 3.2.5
Sistema ChemiDoc MP	BIO-RAD	1708280	Protocollo 3.2.8