Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em> In Vivo</em> L'utilisation d'un test basé sur la cytométrie de flux
Summary
phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est d'évaluer et de quantifier en phagocytose microgliale vivo avec précision. Les microglies sont les macrophages du système nerveux central (SNC) résidentes du tissu. Ils effectuent une variété de fonctions pour assurer le maintien de l'homéostasie tissulaire. Ceux – ci comprennent la surveillance immunitaire, la sécrétion de facteurs neurotrophiques et, d' une importance cruciale, la phagocytose 1. Phagocytose microgliale est la clé de plusieurs événements importants au cours du développement du cerveau et de la rétine, comme la phagocytose des synapses non pertinentes (élagage synaptique) et l' élimination des neurones apoptotiques 2-4. En outre, la phagocytose microgliale de neurones endommagés ou apoptotiques, des débris cellulaires et des microbes envahisseurs a été révélée indispensable au maintien de l' homéostasie du système nerveux central jusqu'à l' âge adulte 5. Enfin, la phagocytose microgliale a été impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer et liée à l'âgela dégénérescence maculaire, où il a été suggéré que la capacité de phagocytose défectueuse ou insuffisante peut contribuer à l'accumulation de l' amyloïde ß (Aß) , des plaques et des druses, respectivement 6,7.
fonction de la microglie est étroitement régulée par leur micro-environnement, notamment par des facteurs solubles tels que le facteur β de croissance tumorale ou les interactions cellule-cellule. Les neurones expriment constitutivement plusieurs ligands de surface cellulaire, tels que le CD200 et CX3CL1, tandis que les microglies expriment exclusivement les récepteurs respectifs CD200R et CX3CR1. Ces récepteurs contiennent immunorécepteur motifs d'inhibition à base de tyrosine (ITIM) dans leur partie intracellulaire. Ces récepteurs inhibiteurs sont essentiels pour empêcher la sur-stimulation de la microglie, ce qui peut contribuer à une neuroinflammation. Ainsi, dans des conditions physiologiques normales, les interactions cellule-cellule entre les neurones et les microglies garder microglie dans un état de repos. Pendant une lésion tissulaire, cependant, les neurones peuvent réguler vers le bas expression de ces ligands, en supprimant leur effet inhibiteur sur la microglie activation. Fonction microglial (y compris la phagocytose) est donc étroitement liée à leur microenvironnement 8. Néanmoins, à ce jour, il n'y a pas des tests standardisés pour étudier la microglie phagocytose dans un contexte physiologique ou d'une manière qui reproduit pleinement leur microenvironnement CNS.
Plusieurs dosages ont été développés pour mesurer l' activité phagocytaire des microglies in vitro, où les cellules microgliales primaires ou de lignées de cellules microgliales sont cultivées avec des cellules cibles (par exemple, les neurones apoptotiques) ou des billes marquées par fluorescence. L' absorption de la cible est alors déterminée en utilisant la microscopie à imagerie de fluorescence ou cytométrie de flux 12/09. Ces essais permettent de tester comment la manipulation pharmacologique ou génétique peut affecter la phagocytose microgliale et, tandis que d' information, ne parviennent pas à répliquer totalement le complexe dans un environnement in vivo. Les méthodes indirectes pour l'examen de la phagocytose microglialein vivo ont été rapportés: ceux – ci sont réalisés par coloration des molécules censées être impliquées dans la phagocytose (par exemple, CD68), l' évaluation de la proximité physique des microglies et des cibles pour la phagocytose (par exemple, des neurones compromis ou éléments synaptiques), soit par détection immunohistochimique de phagocytose cibles dans les cellules microgliales (par exemple, Aß) 13-17. Deux études ont utilisé des approches plus directes pour évaluer la microglie phagocytose in vivo. Hughes et ses collègues ont utilisé des techniques d'imagerie pour mesurer l' absorption de la microglie de perles livrées par voie intracrânienne 18. Sierra et al. A développé une méthode raffinée pour évaluer quantitativement la microglie phagocytose des cellules apoptotiques en utilisant des techniques d'imagerie complexes 4. Cependant, ces procédés impliquent des protocoles compliqués pour la préparation des tissus, le sectionnement, l'imagerie et l'analyse. Nous avons déjà utilisé une analyse de cytométrie de flux pour évaluer la phagocytose du photorécepteur surer segments de cellules rétiniennes épithélium pigmentaire (RPE) dans la culture 19. Ici, nous décrivons un protocole pour évaluer rapidement l' absorption de particules marquées par fluorescence par microglie rétiniennes comme une mesure quantitative de la microglie in vivo phagocytose.
Le protocole que nous décrivons ici permet une mesure fiable et quantitative de la phagocytose microgliale rétinienne dans un peu moins de six heures en trois étapes essentielles: (1) la livraison de intravitréenne de particules marquées par fluorescence, (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien, et (3) Flux l'analyse cytométrique. La méthode que nous avons mis au point une méthode robuste pour évaluer la phagocytose microgliale dans la rétine, et il peut être utilisé avec succès pour tester la façon dont divers composés ou manipulation génétique modifient cette fonction clé dans la microglie paramètres physiologiques. En tant que domaine spécialisé de la CNS, la rétine est un système modèle facilement accessible pour étudier la fonction de microglies 20. Bien que cette méthode a été développée en til oeil, nous croyons qu'il peut être utile pour tous les neuroscientifiques enquête fonction microglie phagocytaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a trois étapes critiques dans cette méthode: (1) l'injection intravitréenne de particules marquées par fluorescence; (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien; et (3) l'écoulement analyse cytométrique. Nous recommandons que les chercheurs pratiquent des injections intravitréennes avant d'effectuer la méthode que nous présentons ici. Souris albinos (par exemple, BALB / c) et une solution de couleur (par exemple, des particules marquées par fluorescence) peuvent êt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
Riferimenti
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