En ny teknik för att generera och observera Chemiluminescence i en biologisk inställning
Summary
This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.
Abstract
Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.
Introduction
Under de senaste decennierna har avbildningstekniker revolutionerat sättet att läkare diagnostisera och övervaka sjukdomar. Dessa avbildningstekniker har dock varit i stort sett begränsade till hela kroppen bildsystem, såsom positronemissionstomografi (PET), enkelfotonemission datortomografi (SPECT), datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRT). Särskild uppmärksamhet har ägnats åt cancer, och tekniska avbildnings genombrott har förbättrats avsevärt det sätt som denna sjukdom diagnostiseras och behandlas. Trots dessa framsteg finns det ett ställe där dessa avbildningstekniker bara inte passar: operationssalen. Medan hela kroppen avbildningstekniker kan bidra till kirurgisk planering, de vanligtvis saknar upplösningar tillräckligt hög för att hjälpa läkare avgöra i realtid om alla tumörvävnaden har tagits bort eller kvarvarande tumörvävnad förblir gömd vid kirurgiska marginaler 1. Att se till att ingen infiltrativtumör marginaler kvar är en av de viktigaste kirurgiska mål och kirurger måste gå en lina mellan strikt och försiktig vävnads resektion. Om för mycket tas bort, är oönskade biverkningar för patienten förvärras; Om för lite är borttagna, är återfallsfrekvens ökade 2, 3. Därför är det viktigt att beskriva exakt tumör marginaler, och vi tror att kemiluminiscent intraoperativ avbildning kan bidra till att förbättra noggrannheten hos identifieringen av tumör marginaler genom att hjälpa kirurger att visualisera malign vävnad som annars skulle kunna förbli oupptäckta med etablerade tekniker.
Det finns många avbildningstekniker för närvarande utreds för deras möjliga användbarhet som intraoperativ bildsystem. Dessa inkluderar P- och γ-strålningsutsändande prober 4, optisk fluorescens 5, Ramanspektroskopi 6 </sup>, 7, och Cherenkov luminiscens 8, 9. Hittills har dock ingen av dessa har etablerat sig som standard kliniska verktyg. Optisk fluorescens avbildning har hittills visat sig vara den mest lovande av dessa tekniker och är därför den mest utforskade. Även om det har redan visat sig vara ett värdefullt verktyg för många tillämpningar, är det inte utan sina begränsningar. I själva verket är dess främsta nackdelen bakgrundsfluorescens som alstras av inneboende autofluorescerande biologisk vävnad. Denna bakgrunds autofluorescerande signalen är en produkt av excitering av den omgivande vävnaden, förutom fluoroforen, av den externa ljuskällan krävs för genereringen av en fluorescerande signal. Ur ett praktiskt perspektiv kan denna autofluorescens potentiellt leda till låga signal-till-brusförhållanden, vilka kan begränsa användbarheten av denna teknologi i operationssalen.
Rektornnytta av kemiluminescens avbildning över fluorescens avbildning är att ingen excitationsljuset är nödvändigt. Som ett resultat finns det ingen bakgrund autofluorescens. I kemiluminescens avbildning, är exciteringsenergin istället genereras kemiskt. Denna process producerar ingen oavsiktlig bakgrundssignal och kan därför resultera i högre signal-till-brusförhållanden. Detta kan i slutändan leda till att mer exakt och korrekt diagnos av kirurgiska marginaler. Något överraskande har användbarheten av denna metod som en intraoperativ bildteknik förblivit outforskad 10. Faktum är att den närmaste exemplet på denna teknik är oxidationen av luminol genom myeloperoxidas hos möss 11, 12, 13. Kemiluminiscenta biomedicinsk avbildning är därför ett ganska outforskat område av forskning som kunde erbjuda följande fördelar: (1) minimal autofluorescens vilket resulterar i en låg bakgrundssignal med hiGher signal-brusförhållanden; (2) avstämbara våglängder av kemiluminiscenta utsläpp som sträcker sig från det synliga till det nära infraröda; och (3) funktionaliserbara kemiluminiscerande komplex som, i kombination med länkteknik och riktade biomolekyler som redan finns, ger tillgång till hela bibliotek av riktade molecular imaging sonder 14.
Detta proof-of-principle studie belyser den potentiella nyttan av kemiluminescent avbildning inom det biomedicinska inställningen med en rutenium-baserad bildanalysmedel. De kemiluminiscenta egenskaperna hos denna förening är väl studerade, med undersökningar som går tillbaka till mitten av 1960-talet 15. Vid kemisk aktivering, producerar agenten ljus vid omkring 600 nm 16, som är väl lämpad för medicinska avbildningsändamål. Aktiveringsenergin tillhandahålls av en redoxreaktion som leder till ett exciterat tillstånd-som har en livslängd på 650 ns i vatten 17 -follskyldig genom alstring av fotoner vid relaxation av detta exciterade tillstånd. Genom att använda en speciellt utformad fjärr nebulisator, kunde vi upptäcka föreningen både ex vivo och in vivo. Resultaten av initiala experiment är mycket lovande, vilket tyder på ytterligare utredning av denna teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi presenterat en teknik som är i stånd att optiskt delineating vävnad via emission av fotoner som skapats av en kemiluminescent reporter. I motsats till andra, mer etablerade, teknik 4, 5, 6, 7, 8, 9, här kemiluminescerande reportersystem utnyttjar en avbildningssonden som är icke-radioaktiv och underlättar d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.
Materials
| Wood part A (12.5×2.5×1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7×10.7×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11×2.5×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4×25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 – 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
Riferimenti
- Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. . Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. , (2015).
- Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation – a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13 (9), 653-662 (2013).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41 (3), 166-181 (2011).
- van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17 (10), 1315-1319 (2011).
- Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (25), E2288-E2297 (2013).
- Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
- Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53 (9), 1438-1445 (2012).
- Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55 (1), 95-98 (2014).
- Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15 (4), 455-461 (2009).
- Lee, J. -. J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49 (29), 3016-3018 (2013).
- Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6 (10), 765-769 (2007).
- Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2 (12), 1025-1030 (2010).
- Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88 (1), 170-202 (2016).
- Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88 (20), 4745-4746 (1966).
- Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
- Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. . Handbook of Photochemistry 3rd Ed. , 379-404 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. , (2016).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9 (3), 371-381 (1956).
- Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
- Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
- Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54 (5), 663-670 (1965).
- Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. . IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. , (1983).
- Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
- Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112 (8), 2949-2957 (2008).
- Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84 (6), 2769-2775 (2012).
- Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
- Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21 (40), 14146-14155 (2015).
- Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9 (5), 1146-1159 (2014).
- Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79 (1), 171-180 (2014).
- Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).
- Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
- Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
- Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139 (22), 6028-6035 (2014).
