G Белково-селективные GPCR Конформации Измеряется с использованием FRET датчиков в прямом эфире клеточной суспензии Флуорометр Пробирной
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster резонансный перенос энергии (FRET) основе исследования становятся все более распространенными в исследовании сигналов GPCR. Наша исследовательская группа разработала внутримолекулярной датчик FRET для обнаружения взаимодействия между Gα субъединиц и GPCRs в живых клетках после агонистом стимуляции. Здесь мы подробно протокол для обнаружения изменений в FRET между β 2 адренергического рецептора и С-концевого пептида Gαs после обработки 100 мкМ изопротеренол гидрохлорида , как ранее характеризовался 1. Наш датчик FRET представляет собой единый полипептид, состоящий поочередно из полнометражного GPCR, лобзиком акцепторного флуорофора (mCitrine), ER / K СПАЗМЫ (систематическое сродство белка сила модуляции) линкер, донор FRET флуорофор (mCerulean) и Gα C терминальный пептид. Этот протокол будет подробно подготовка клеток, условия трансфекции, установки оборудования, выполнение анализа и анализа данных. Этот экспериментальный дизайн обнаруживает небольшой чAnges в FRET свидетельствует о белок-белковых взаимодействий, а также могут быть использованы для сравнения силы взаимодействия через лигандов и ХВГФ-G белка спариваний. Для того, чтобы усилить сигнал-шум в наших измерениях, этот протокол требует повышенную точность на всех этапах, и представлена здесь для того, чтобы воспроизводимый исполнение.
Introduction
G-белками рецепторы (GPCRs) семь-трансмембранные рецепторы. Один только геном человека содержит около 800 генов, кодирующих GPCR,, которые активируются различными лигандами, включая свет, отдушек, гормонов, пептидов, лекарственных средств и других небольших молекул. Около 30% всех лекарственных средств в настоящее время на целевом рынке GPCRs , потому что они играют большую роль во многих болезненных состояний 2. Несмотря на десятилетия обширной работы, проделанной по этому семейству рецепторов, остаются значительные нерешенные вопросы в этой области, в частности в отношении молекулярных механизмов, которые управляют GPCR-эффекторных взаимодействий. На сегодняшний день только одна кристаллическая структура с высокой разрешающей способностью были опубликованы, обеспечивая представление о взаимодействии между β 2 адренергического рецептора (β 2 -АР) , и белок Gs 3. Вместе с обширные исследования в течение последних трех десятилетий, он повторяет один конкретный структурный компонент, который имеет решающее значение в этомВзаимодействие: The Gα субъединицей С-концевом участке. Эта структура имеет важное значение как для G активации белка путем выбора белка GPCR 4 и G 5-6. Следовательно, Gα С-конец обеспечивает важную связь между лигандом стимуляции GPCR и селективной активации белка G.
Исследования, проведенные за последнее десятилетие показывает, что GPCR, заселить широкий конформационные пейзаж с лиганд-связывающим стабилизирующим подмножеств GPCR конформации. В то время как несколько методов, в том числе кристаллография, ЯМР и флуоресцентной спектроскопии и масс – спектрометрии можно исследовать конформационные ландшафт GPCR, существует недостаток подходов к выяснению их функциональное значение в выборе эффекторной 7. Здесь мы очертить подход Fӧrster -На резонансный перенос энергии (FRET) для обнаружения белка G-селективных GPCR конформации. FRET зависит от близости и параллельной ориентации двух флуорофоров с перекрытием выбросов (доноров) аго возбуждения (акцептор) спектры 8. В качестве донора и акцептора флуорофоров сближаются в результате либо конформационных изменений в белке или белок-белкового взаимодействия, лада между ними увеличивается, и может быть измерена с помощью ряда методов 8. FRET на основе биосенсоров широко используются в области GPCR 9. Они использовались, чтобы исследовать конформационные изменения в GPCR, вставив донора и акцептора в третьем цикле внутриклеточного и GPCR С-конца; Датчики были разработаны для исследования GPCR и эффекторных взаимодействий по отдельности мечения GPCR и эффектор (G белковых субъединиц / arrestins) с FRET пары 10; некоторые датчики также обнаружить конформационные изменения в белке G 11. Эти биосенсоры позволили поле , чтобы задать множество нерешенных вопросов , в том числе конформационных изменений в GPCR и эффектора, кинетика взаимодействия GPCR-эффекторов и аллостерических лигандов 12. Наша группабыл особенно заинтересован в создании биосенсоров, которые могли бы обнаружить белок G-специфический GPCR конформации под агонистом приводом условиях. Этот биосенсора основывается на недавно разработанной технологии под названием СПАЗМЫ (систематическое сродство белка сила модуляции) 13. СПАЗМЫ включает привязывать взаимодействующих доменов белка с использованием ER / K компоновщик, который контролирует их эффективные концентрации. Обрамление линкер с FRET пары флуорофоров создает инструмент , который может сообщать о состоянии взаимодействия между белками 12. Ранее 1 модуль СПАЗМЫ был использован для привязывать к Gα С-концом к GPCR и контролировать их взаимодействие с FRET флуорофоров, mCitrine (далее в данном протоколе его широко известный вариант, желтый флуоресцентный белок (YFP), возбуждение / пик излучения при 490/525 нм) и mCerulean (далее в настоящем протоколе его широко известный вариант Cyan флуоресцентный белок (CFP), возбуждение / пик излучения 430/475 нм). От N- к С-концу, тего генетически кодируемых отдельный полипептид содержит: полная длина ХВГФ, лада акцептор (mCitrine / YFP), 10 нм ER / K компоновщик, лада донор (mCerulean / СФП), а Gα С-конец пептида. В этом исследовании, датчики сокращенно GPCR-линкер длиной Gα пептида. Все компоненты разделены неструктурированной (Gly-Ser-Gly) 4 линкера , который позволяет свободное вращение каждого домена. Подробная характеристика таких датчиков была ранее выполнена с использованием двух прототипические GPCRs: β 2 -АР и опсина 1.
Этот датчик трансфицированы в НЕК-293Т и флуорометре на основе экспериментах с клеточными мера спектров флуоресценции пары FRET в произвольных единицах число импульсов в секунду (CPS) в присутствии или в отсутствие лиганда живого. Эти измерения используются для вычисления соотношения FRET между флуорофоров (YFP макс / CFP макс). Изменение в FRET (ΔFRET) рассчитывается путем вычитания среднего отношения FRETнеочищенных образцов из соотношения лада лиганда образцах, обработанных. ΔFRET можно сравнить между конструкциями (β 2 -АР-10 нм-Gαs пептида по сравнению с не & beta ; 2–AR 10 нм не пептид). Здесь мы подробно протокол, чтобы выразить эти датчики в НЕК-293Т живых клеток, следить за их выражение, а установка, выполнение и анализ Флуорометр на основе живых клеток FRET измерения для необработанных клеток по сравнению условий наркотиков лечение. В то время как этот протокол является специфическим для β 2 -АР-10 нм-Gαs пептидной датчика обрабатывали 100 мкМ изопротеренол битартрат, она может быть оптимизирована для различных пар ХВГФ-Gα и лигандов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Плотный динамический диапазон измерений FRET в этой системе усиливает необходимость чувствительного контроля качества на каждом этапе этого протокола. Наиболее важные шаги для обеспечения успешного эксперимента FRET являются: 1) для культивирования клеток, 2) трансфекцию 3) экспрессии бе?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
РОМ финансировалось Американской кардиологической ассоциации Pre-докторских стипендий (14PRE18560010). Исследование финансировалось Американской кардиологической ассоциации Grant Scientist развития (13SDG14270009) и НИЗ (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) в СС
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
Riferimenti
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors – added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
